生产菌种的培养与保存资料复习进程

1、生产菌种的培养与保存资料实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。阶段的种子培养。生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。为生产车间阶段。 种子扩大培养种子扩大培养是指将保存在砂土管、是指将

2、保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养子罐逐级扩大培养, ,最终获得一定数量和质最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。种子扩培的目的种子扩培的目的q 接种量的需要接种量的需要q 菌种的驯化菌种的驯化q 缩短发酵时间、保证生产水平缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：种子的要求：q 总量及浓度能满足要求总量及浓度能满足要求q 生理状况稳定，个体与群体生理状况稳定，个体与群体q 活力强，移种至发酵后，能够迅

3、速生长活力强，移种至发酵后，能够迅速生长q 无杂菌污染无杂菌污染一、孢子的制备一、孢子的制备放线菌孢子的制备：放线菌孢子的制备： 营养要求：营养物质含量要低，特别是氮源营养要求：营养物质含量要低，特别是氮源 培养基：琼脂斜面培养基培养基：琼脂斜面培养基 培养温度：培养温度：2837 培养时间：培养时间：514天天 斜面含水量：低斜面含水量：低 棒状链霉菌成熟单菌落生棒状链霉菌成熟单菌落生长丰满，紧密，菌落呈草帽形，长丰满，紧密，菌落呈草帽形，中间突起，气生菌丝颜色为白中间突起，气生菌丝颜色为白色，基内菌丝由浅黄到灰黄，色，基内菌丝由浅黄到灰黄，都不产生可溶性色素，孢子为都不产生可溶性色素，孢子

4、为暗灰绿色，成熟后，孢子易于暗灰绿色，成熟后，孢子易于刮下刮下 棒状链霉菌出发菌株单菌落形态特征棒状链霉菌出发菌株单菌落形态特征 棒状链霉菌斜面一棒状链霉菌斜面一般培养四到五天左右产生般培养四到五天左右产生孢子，六到七天斜面孢子孢子，六到七天斜面孢子生长成熟，气生菌丝颜色生长成熟，气生菌丝颜色为白色，基内菌丝由浅黄为白色，基内菌丝由浅黄到灰黄，都不产生可溶性到灰黄，都不产生可溶性色素，孢子呈暗灰绿色色素，孢子呈暗灰绿色 棒状链霉菌出发菌株的斜面培养特征棒状链霉菌出发菌株的斜面培养特征 霉菌孢子的制备：霉菌孢子的制备： 营养要求：碳、氮含量要低，无机盐适量营养要求：碳、氮含量要低，无机盐适量 培

5、养基：天然农产品培养基：天然农产品 培养温度：培养温度：2528 培养时间：培养时间：414天天 细菌种子的制备：细菌种子的制备： 营养要求：营养丰富，氮源含量要高营养要求：营养丰富，氮源含量要高 培养基：牛肉膏、蛋白胨培养基：牛肉膏、蛋白胨 培养温度：培养温度：37 培养时间：培养时间：12天（芽孢天（芽孢58天）天）二、摇瓶种子的制备二、摇瓶种子的制备一级摇瓶一级摇瓶 二级摇瓶二级摇瓶 种子罐种子罐三、种子罐种子的制备三、种子罐种子的制备一级种子罐一级种子罐 二级种子罐二级种子罐 发酵罐（三级发酵）发酵罐（三级发酵）级数的确定：菌种的特性；发酵罐的体积级数的确定：菌种的特性；发酵罐的体积谷

6、氨酸：三级发酵谷氨酸：三级发酵一级种子（摇瓶）一级种子（摇瓶）二级种子二级种子 （小罐）（小罐）发酵发酵青霉素：三级发酵青霉素：三级发酵一级种子一级种子 （小罐）（小罐）二级种子（中罐）二级种子（中罐）发酵发酵 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。发酵级数确定的依据发酵级数确定的依据q 级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响q 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般般2-4级。

7、级。q 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面的一个方面四、四、 种子制备过程举例种子制备过程举例1、谷氨酸生产的种子制备、谷氨酸生产的种子制备制备过程制备过程斜面菌种斜面菌种一级种子培养一级种子培养二级种子培养二级种子培养发酵发酵斜面斜面 (AS1.299)培养基：蛋白胨培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏，牛肉膏1%，氯化钠，氯化钠 0.5 琼脂琼脂 2%， pH 7.0-7.2培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：培养条件：32，生长，生长18-24小时小时 生长斜面要求：生长良

8、好，所使用斜面连续传代不超生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过过3次次一级一级种子（摇瓶）种子（摇瓶）培养条件：于培养条件：于1000ml三角瓶中，装液三角瓶中，装液200-250ml,32培培 养养12小时小时培养基：葡萄糖培养基：葡萄糖2%，尿素，尿素0.5%，玉米浆，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基本接近于发酵培养基二级种子二级种子(种子罐种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），）， 32培养培养

9、7-10个小时个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 浓度为浓度为2.5%培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基种子的质量要求：种子的质量要求：108-109个个/ml大小均匀，呈单个或八字排列大小均匀，呈单个或八字排列pH 7.0-7.2时结束，时结束，6.887.0-7.2活力旺盛活力旺盛2、青霉素生产的种子制备、青霉素生产的种子制备制备过程制备过程安培管安培管 斜面孢子斜面孢子 大米孢子大米孢子 一级种子一级种子 二级种子二级种子 发酵发酵斜面孢子斜面孢子培养基：甘油、培养基：甘油、

10、 葡萄糖、葡萄糖、 蛋白胨等蛋白胨等培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细培养条件：培养条件：25、7天天, 注意湿度注意湿度50%左右左右大米孢子大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。的白点小）有利于孢子的生长。培养条件：培养条件：25、7天，控制湿度天，控制湿度大米孢子的要求：大米孢子的要求：1粒米含粒米含1.4*106个孢子个孢子一级种子一

11、级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆目的：长菌体目的：长菌体培养条件：培养条件：27，40小时小时接种量：接种量：200亿孢子亿孢子/吨吨二级种子二级种子培养基：同上培养基：同上培养条件：培养条件：27、10-14小时小时接种量：接种量：10%种子的质量要求种子的质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于期期青霉素发酵菌丝体的生长共分为青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，个期，1-4为年青期，为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强期合成青霉素的能力最强第二节第二节 生产菌种的质量控制生产菌种的质

12、量控制一、影响孢子质量的因素一、影响孢子质量的因素1.培养基培养基营养成分营养成分灭菌的质量灭菌的质量斜面培养基的含水量斜面培养基的含水量2.培养温度和湿度的影响培养温度和湿度的影响 菌体生长温度范围宽些菌体生长温度范围宽些2837 ，孢子，孢子形成温度窄形成温度窄27、283.培养时间培养时间 过短：孢子不成熟；低温保藏时、易死亡过短：孢子不成熟；低温保藏时、易死亡 过长：菌体代谢活力降低，产量低过长：菌体代谢活力降低，产量低4.保藏时间保藏时间 一般不超过一星期一般不超过一星期5.接种量接种量 在母斜面上形成单菌落，在子斜面上在母斜面上形成单菌落，在子斜面上形成一层菌落形成一层菌落二、影响

13、种子质量的因素及控制措施二、影响种子质量的因素及控制措施1.影响因素：影响因素：培养基培养基培养条件培养条件培养时间培养时间 最适种龄：对数生长期后期最适种龄：对数生长期后期 种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。相对较大，但是最终由实验结果定。菌龄过小：延迟期长，菌体生长缓慢，生物菌龄过小：延迟期长，菌体生长缓慢，生物合成期缩短，产量降低合成期缩短，产量降低种龄长：易老化种龄长：易老化

14、接种量接种量 接入种子液的体积接入种子液的体积 接入后培养液体积接入后培养液体积 接种量范围：接种量范围：125%，但是一般认为大一点好，但是一般认为大一点好 过大：菌体过度生长，营养物质及溶氧不能满足过大：菌体过度生长，营养物质及溶氧不能满足 菌体需要，使菌体衰老、自溶菌体需要，使菌体衰老、自溶 过小：生产期延长，以产生菌丝结团，产量降低过小：生产期延长，以产生菌丝结团，产量降低接种量接种量= 100%双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。 2.种子质量的控制

15、指标种子质量的控制指标菌体的形态菌体的形态碳、氮、磷的代谢情况碳、氮、磷的代谢情况菌株的生产能力菌株的生产能力特殊酶活力特殊酶活力3.种子异常分析种子异常分析菌丝生长过慢：培养基质量不好；灭菌质量菌丝生长过慢：培养基质量不好；灭菌质量 不好；通入空气的温度过低不好；通入空气的温度过低菌丝结团：接种量小；培养基粘度不当；搅菌丝结团：接种量小；培养基粘度不当；搅 拌不好拌不好菌丝粘壁：搅拌不好；装料系数少；泡沫多菌丝粘壁：搅拌不好；装料系数少；泡沫多第三节第三节 生产菌种的保藏生产菌种的保藏一、微生物菌种的保藏要求一、微生物菌种的保藏要求要求：要求： 是广泛是广泛收集收集各种研究、教学和生产性菌种

16、，各种研究、教学和生产性菌种，满足各方面需求；满足各方面需求； 高质量保藏高质量保藏，即要求保藏的菌种不死亡、活，即要求保藏的菌种不死亡、活性不衰老、特性不变异、分类不紊乱；性不衰老、特性不变异、分类不紊乱； 随时可随时可提供提供保持有原始特性的菌种用于交换保持有原始特性的菌种用于交换和使用。和使用。二、菌种保藏原理二、菌种保藏原理原理：原理： 将微生物菌种保存在将微生物菌种保存在不利于微生物活跃生长和代不利于微生物活跃生长和代谢的不良环境谢的不良环境中，如干燥、低温、缺氧、黑暗、营养中，如干燥、低温、缺氧、黑暗、营养饥饿等等，使微生物代谢速率极为缓慢或处于休眠状饥饿等等，使微生物代谢速率极为

17、缓慢或处于休眠状态。态。 而一旦而一旦恢复恢复所保存菌种生长的正常环境和营养条所保存菌种生长的正常环境和营养条件，即可获得具有高生理活性和保持原种优良性状的件，即可获得具有高生理活性和保持原种优良性状的菌种培养物。菌种培养物。三、微生物菌种保藏的常用方法三、微生物菌种保藏的常用方法菌种保藏的方法有多种多样，常用方法简介如下：菌种保藏的方法有多种多样，常用方法简介如下： 1 1、斜面低温保藏法、斜面低温保藏法 2 2、 液体石蜡封藏法液体石蜡封藏法 3 3、 沙土管保藏法沙土管保藏法 4 4、甘油低温保存法、甘油低温保存法 5 5、真空冷冻干燥保藏法、真空冷冻干燥保藏法 6 6、液氮超低温保藏法

18、、液氮超低温保藏法1 1、斜面低温保藏法、斜面低温保藏法 4 4保存，保存，13月月2 2、 液体石蜡封藏法液体石蜡封藏法石蜡石蜡灭菌灭菌冷却冷却加入试管中加入试管中 3 3、 沙土管保藏法沙土管保藏法 1mol/L酸洗酸洗 1mol/L碱洗碱洗 蒸馏水洗蒸馏水洗 烘干烘干 过筛过筛 混合（混合（3：2或或1：1） 分装沙土管分装沙土管 干接法：接孢子后，低温抽真空干接法：接孢子后，低温抽真空 湿接法：接孢子悬液后，低温抽真空湿接法：接孢子悬液后，低温抽真空取沙取沙取土取土（沙（沙:2040目）目）（土（土:4060目）目）4 4、 甘油低温保藏法甘油低温保藏法 等体积混合等体积混合 -20以

19、下保存以下保存孢子悬液或菌体孢子悬液或菌体3040%甘油甘油 如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含1010甘甘油的新配制液体培养基油的新配制液体培养基洗涤洗涤收获。超低温冰箱的冷冻收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在速度一般控制在1-21-2minmin。若干细菌和真菌菌种可。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏通过此保藏方法保藏5 5年而活力不受影响。年而活力不受影响。 通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最最为有效的方

20、法之一。为有效的方法之一。 冷冻干燥过程中必须使用冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂冷冻保护剂，目前国内，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有应用动物血清等的。常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有应用动物血清等的。 大部分微生物菌种可以在冻干状态下大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏保藏10年年之之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻无需进行冷冻保藏，便于运输。保藏，便于运输。5、真空冷冻干燥保藏法、真空冷冻干燥保藏法 等体积混合等体积混合 分装冻干分装冻干管管 冷冻至冷冻至15 以下以下 抽真空抽真空 封口封口 低温保存低温保存脱脂牛奶脱脂牛奶孢子悬液（洗净）孢

21、子悬液（洗净）冻干菌种的保藏与再生冻干菌种的保藏与再生1保藏：冷冻干燥后的培养物在低于保藏：冷冻干燥后的培养物在低于5下保藏。下保藏。较低的保藏温度较低的保藏温度(-20-70)对于培养物的对于培养物的长期稳定更好长期稳定更好。2复苏：复苏：(1)在超净工作台中用在超净工作台中用70酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。中锉一道沟。(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿(3)在安瓿中加入在安瓿中加入0.51ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿。然营养液体培养基，慢慢旋转安瓿。然后将此转接到一含有再

22、生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。面或涂布平板。(4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有l2ml液体培养基的试管中，轻轻振荡液体培养基的试管中，轻轻振荡5l0min，然后用此悬液，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。接种适宜的再生培养基。6 6、液氮超低温保藏法、液氮超低温保藏法 10% 甘油悬液甘油悬液 降温至降温至0 缓慢降温至缓慢降温至 -35 放入液氮缸中放入液氮缸中 液相：液相： -196 （ 气相：气相： -150 ）孢子悬液、孢子悬液

23、、 (一一)冷冻保护剂冷冻保护剂 在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是护剂是二甲亚砜和甘油二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一，最终使用浓度一般为甘油般为甘油10、二甲亚砜、二甲亚砜5。所使用的。所使用的甘油一般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最甘油一般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。好为过滤灭菌。 (二二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤1待冷冻保藏菌种悬液的制备待冷冻保藏菌种悬液的制备(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含含10甘油的甘油的营养液体培养；吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；营养液

24、体培养；吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.51ml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，(2)从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；则需先用玻璃珠打散；0.5-1ml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于于5冰箱中冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。，以使细

25、胞和悬浮培养基之间达到平衡。 2控速冷冻控速冷冻(1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；中；(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；(3)以以1-2/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点度的细胞冻结点(通常为通常为-30)；(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；相变；(5)细胞冻结后，将致冷速度降为细胞冻结后，将致冷速度

26、降为1/min，直到温度达，直到温度达-50；(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196)或或 气相气相(-156)中中保存。如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于保存。如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于-70冰冰箱中冷冻箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。，然后迅速移入液氮罐中保存。(三三)复苏复苏 1从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2迅速将安瓿置于迅速将安瓿置于37-40水浴中，并轻轻摇动以加速解冻；水浴中，并轻轻摇动以加速解冻；3用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有用巴氏吸管将安瓿中贮

27、存培养物移接入含有2ml无菌液体培养无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml (约约4、8滴滴)转接入琼脂斜面上。转接入琼脂斜面上。常用菌种保藏方法的比较常用菌种保藏方法的比较方法方法原理原理适宜菌种适宜菌种保藏时间保藏时间特点特点冰箱低温冰箱低温（4 4）低温低温各大类微生物各大类微生物3-63-6个月个月简便简便石蜡油封藏石蜡油封藏低温、缺氧低温、缺氧各大类微生物各大类微生物1-21-2年年简便简便砂土保藏砂土保藏干燥、无营干燥、无营养养产芽孢细菌、产芽孢细菌、产孢子的放线产孢子的放线菌、霉菌菌、霉菌1-101-10年年简便有效简便有效冷冻干燥保冷冻干燥保藏藏干燥、低温、干燥、低温、无氧无氧各大类微生物各大类微生物5-155-15年以上年以上繁而高效繁而高效基因工程菌的保藏基因工程菌的保藏 由载体质粒等携带的外源由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不片段通常是遗传不稳定的、且稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。为宿主细胞生长非必需。 一般情况下当细胞丢失这些质粒时，一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会