化学毒物的生殖毒性以及临床研究

1、化学毒物的生殖毒性以及临床研究 生殖过程是一个连续的循环过程，但为了研究和叙述的方便，常将其分为 生殖（reproduction） 发育（development） 生殖（reproduction）是人和哺乳动物繁衍种族的复杂的生理过程，包括两性生殖细胞或称配子的发生，即精子发生(spermatogenesis)和卵子发生（cogenesis）、配子的释放、性周期和性行为、卵细胞受精（fertilization）、受精卵卵裂、胚泡形成、植入(implantation)或着床（imbed）、胚胎形成、胚胎发育、器官形成、胎儿发育、分娩和哺乳、出生后发育直至性成熟，又繁殖下一代。 生殖与发育过程的每

2、个阶段所涉及的细胞或器官都可能成为外源化学物毒作用的靶。 对大量化学毒物的研究表明：对大多数化学毒物来说生殖系统比其他系统更敏感。因此，在化学毒物安全性评价中生殖系统至关重要。生殖毒理的研究目的通过动物实验获得剂量-反应关系;研究化学毒物对生殖系统的毒作用机制；进行人群流行病学研究；对某个化学毒物进行生殖毒性的安全性评价。常用有关术语与基本概念1、生殖功能障碍(reproduction dysfunction)：由父方与/或母方接触化学毒物导致干扰受孕、孕体、发育、出生以及后代成熟为健康成人。2、生殖毒性（reproduction toxicity）：是指外源化学物对雄性和雌性生殖功能或能力以

3、及对后代产生的不良效应 。包括：生育力与一般生殖行为；致畸形；对孕后期与哺乳（围生期、出生后）的不良效应。3、生殖毒理学(reproduction toxicology)：研究化学毒物抑制或干扰卵子和精子生成机制和对后代发育的不良作用，为安全性评价与预防提供依据。4、发育毒性(development toxicity)：化学毒物在着床前胚泡、器官形成，胎儿和新生儿各发育阶段干扰正常发育过程，称为发育毒性。不同的化学毒物作用于不同发育阶段。过早或过迟接触都可能不产生效应。出生时发育毒性的四大表现为：胚胎胎儿死亡；结构异常；生长发育迟缓；功能缺陷。5、胚胎-胎儿毒性（embryofetal tox

4、icity）：指发育毒性中的胚胎-胎儿生长发育迟缓和功能缺陷两项。6、致畸性（teratogenicity）、致畸作用（teratogenic effect）：均指化学毒物可能引起后代畸形的特性或作用。7、 畸形(malformation):器官形态结构的异常。8、 畸胎(terate):具有畸形的胚胎或胎仔。9、致畸物(teratogen):凡在一定剂量下，能通过 母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰， 使其出生后具有畸形的化学毒物。10、致畸试验（teratology study）：评定外来化 合物是否具有致畸作用的试验。 11、致畸敏感期（critical period） 亦称器官形成期

5、（organogenesis period）：胚胎从着床到继发腭闭合（表示器官形成基本结束），这段时间对化学毒物最敏感，故称敏感期。12、母体毒性(maternal toxicity)：是指化学毒物对孕母产生的损害作用，如表现为增重减慢、功能异常、临床症状，甚至死亡。第一节 雄性生殖毒性 、雄性生殖细胞的发生过程 精子生成是一连续发生过程，从一个精原细胞分化成为成熟的精子，在不同的物种和品系中所需要的时间并不相同：人类 64d小鼠 35d兔 43dwistar大鼠公牛 54d 二、外源化学物的雄性生殖毒性1、对睾丸生精细胞的影晌2、对内分泌功能的影响 3、对性功能和生殖功能的影响 三、雄性生殖

6、毒性的检测方法（一）精子分析：1、精子计数：精子数是雄性性功能的一项重要指标，可提供有关精子发育与成熟方面的粗略信息。2、精子形态观察 精子的形态通过伊红染色在显微镜下观察。精子头部和尾部的形态学改变 3、精子状态分析试验 包括精液的pH、液化时间，精子运动能力，蛋白质、脂质和微量元素的含量等。 (二)精子穿透试验：(三)睾丸中标志酶活性的测定：一类为透明质酸酶、山梨醇脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶同工酶x(LDH-x)、5-核苷酸酶、-磷酸甘油脱氢酶等，在精母细胞和精细胞中首先出现，其含量和活性随精子的形成、成熟而达到高峰。另一类为6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、三磷酸甘油醛脱氢酶、异柠檬

7、酸脱氢酶、-谷氨酰转肽酶、尿苷二磷酸酶、鸟氨酸脱羧酶等，在睾丸足细胞、间质细胞或精原细胞内含量最高，其含量和活性在性成熟前达到高峰，并随精母细胞、精细胞和精子的形成、成熟而降低。(四)体外试验： 主要是将哺乳动物的生殖细胞在体外条件下进行培养，并与受试外源化学物接触，观察生殖细胞的变化。通过支持细胞和间质细胞等体外分离培养，测定支持细胞的乳酸含量和乳酸脱氢酶活性的变化以及测定间质细胞分泌的雄激素含量来判断外源化学物是否对所培养细胞的功能有影响。对分离培养的支持细胞和间质细胞，亦可通过细胞计数和形态学检查的方法来判断外源化学物是否对支持细胞和间质细胞有损害作用。若细胞受到损害，则表现出固缩、脱壁

8、、死亡及崩解。(五)雄性激素检测： 睾丸的功能主要靠卵泡刺激素(FSH)、黄体生成激素(LH)和雄激素(主要为睾酮)来维持和调节。 FSH 可促迸睾丸内精子的发生。 LH 可刺激睾丸间质细胞发育，使其分泌雄 性激素，主要是睾丸酮。雄激素可能促进精细胞的增值与分化及维持性 功能。(六)显性致死试验： 通过给予雄性动物受试化学物，将其与未经受试物处理的雌性动物交配，观察雌性动物早期胚胎死亡情况，以评价受试物是否对雄性动物的生殖有损害作用的试验。 (七)雄性生殖细胞遗传毒性检测： 小鼠睾丸染色体畸变分析试验 小鼠精子畸变分析试验 黑腹果蝇染色体性隐性分析试验 (八)雄性生殖毒性病理检查： 睾丸、附睾

9、、前列腺以及精囊的重量和大小的改变常是接触有害外源化学物的明显征兆。 从解剖、病理学观察等形态学角度评价外源化学物对雄性生殖系统的毒性作用，是雄性生殖毒理学研究中不可缺少的较为敏感的指标和重要手段。 第二节 雌性生殖毒性一、雌性生殖细胞的发生过程二、外源化学毒物的雌性生殖毒性雌性哺乳类的生殖过程包括：性器官的成熟；卵细胞的发育与具有受精能力；性功能、性欲和性行为；卵受精和着床；胚胎和胎儿发育；分娩和授乳。这一系列过程中任何一环节受到损害，均可对生殖功能产生不良影响，不仅损害母体，而且危害后代。1、对卵细胞的损害 无论是身体细胞还是卵 细胞受到损害都有可能影响其后代的健康 与幸福；2、受孕后身体

10、生理变化 可增加对化学毒物 的敏感性；3、对性激素和性周期的作用 所有干扰中枢 神经系统和性腺调节GnRH或LHRH合成与释 放的信息传递的外源化学毒物都有可能影 响性激素的产生与作用，化学毒物能进入 大脑，损害下丘脑，干扰性激素从而影响 正常的月经周期和排卵；4、性行为 在很大程度上受精神心理因素影 响，外源化学毒物的作用与之混杂在一起；5、对孕体的损害 从卵细胞受精到胎儿出生前统称为孕体(conceptus）。（1）着床前期：这时受损伤的胚泡容易死亡，称为着床前丢失（preimplantation loss）。（2）胚胎期：即器官发生期，啮齿类在第716天，人是第38周（又称胚期）。这期的

11、特点是细胞移动和组合，形成器官原基，四肢和颜面形成等。这时期特别容易诱发器官结构的缺陷，即结构畸形，故又称敏感期；也可能引起胚胎死亡。 啮齿类胚胎死亡后被吸收，称为吸收胎（resorption），在人则以流产告终，人的胚胎约50死亡。 畸形的发生取决于化学毒物的性质、剂量以及给予的时间。在胚胎期中不同日给予致畸物会诱发不同器官畸形，因为不同器官的敏感期有差别，过早或过迟反而不引起畸形。（3）胎儿期：啮齿类是第8天以后，人是第9-41周，这时孕体称胎儿。这期主要是组织与器官的继续生长与分化，功能逐渐成熟。死亡的胎儿称为死胎，在啮齿类也不能吸收，留在子宫内，以后产出，称死产。 发育毒性四大类表现中

12、死亡、畸形、生长迟缓易判断。功能不全研究相对较少，因为往往出现较迟，较难检查出，常被忽视。三、雌性生殖毒性的检测方法(一)体外试验 Amann等(1982年)曾对雌性生殖毒性提出一个较为全面的试验方案，见表7-2（P127-128） 在雌性生殖毒性评价中，包括多种体外试验方法，能说明生殖器官多方面的功能及完整性。体外试验对于阐明化学毒物的毒性作用机理具有重要意义。 (二)动物试验 在毒理学领域中，生殖与发育毒性的确切评定较为困难。原因在于:许多不同的生殖与发育阶段都可以诱发损害作用;损害作用的后果多种多样，可以是结构损伤或者功能损伤，并可表现在不同的器官等;损害作用可表现在初生时期或发育成熟以

13、后，即可表现在整个生命过程的不同阶段。(三)其它辅助试验 雌性动物动情周期观察、排卵观察、雌激素水平的测定、病理组织学测定等一些辅助试验。这些试验不仅可对雌性生殖毒性做出估计，而且对中毒机制的探讨具有重要意义。第三节 生殖与发育毒性试验的目的和 实验设计的要点一、生殖与发育毒性研究的目的： 揭示化学品对哺乳动物生殖发育的任何有害影响，并将研究的结果与所有可以得到的其他毒理学资料联系起来，以推测对人可能造成的生殖危险。（应包括成年动物和从受孕到子代性成熟的各个发育阶段接触受试物、应连续通过一个完整的生命周期）。完整的生殖发育过程细分为如下阶段。A阶段 交配前到受孕：检查成年雄性和雌性生殖功能，配

14、子的发育与成熟，交配行为，受精。B阶段 受孕到着床：检查成年雌性生殖功能，胚胎着床前发育、着床。C阶段 着床到硬腭闭合：检查成年雌性生殖功能，胎体发育，主要器官形成。D阶段 硬腭闭合到妊娠结束：检查成年雌性生殖功能、胎体的发育与生长，器官的发育与生长。E阶段 出生到断乳：检查成年雌性生殖功能，新生仔对宫外生活的适应，断乳前的发育与生长。F阶段 断乳到性成熟：检查断乳后的发育与生长，对独立生活的适应，达到完全的性功能。二、实验设计的要点：（一）、动物选择必须以哺乳动物为实验对象。 原则：实验动物对受试物的动力学、毒效学及其他有关参数应与人最接近，如代谢过程与生物转化应与人相近、胎盘结构与人相似、

15、健康、生育力强、多产、孕期短、自发畸形率低、价廉、易得和操作方便。 （二）、剂量设计 高剂量应该在母体中产生轻度的毒性 ； 低剂量不应有任何可归因于受试物的有害作 用； 中剂量在高、低剂量之间按等比级差定位， 应引起最小的毒作用。（三）、接触途径与频率 应与人的接触途径相同 。（四）、对照组（溶剂对照组和阳性对照组） 用与试验组相同的最大容量的赋形剂 、阳性物 化学毒物的生殖毒性评价需四方面资料：1环境流行病学资料；2控制下的临床研究；3动物毒性试验；4体外试验。动物生殖毒性试验优点：容易控制暴露条件，暴露动物数量、年龄、状态以及选择检测效应指标（终点）；动物试验预测化学毒物对人类的致畸性，灵

16、敏度较高。缺点：实验结果外推到人有不肯定性，预测对人的致畸性特异性不够高；从较高剂量暴露结果外推到人（暴露较低剂量）有一定困难，人与人之间的个体差异比动物的更大。第四节 致畸试验 一、动物致畸试验(一)、基本原理 致畸试验是检查受试外源化学物能否通过妊娠母体引起胚胎毒性或后代畸形的动物试验。通过致畸试验可以确定一种受试物是否具有致畸作用。 胚胎在器官形成期，可因受到化学物或放射性物质的作用，使细胞分化、器官形成和正常发育受到阻滞，以致出现胎仔器官的器质性缺陷而呈现畸形。 (二)、基本方法(1)、动物选择 除参照毒性试验中选择动物的一般原则，还应特别注意妊娠期较短而一致、产仔数多和胎盘结构与人类

17、接近且自发畸形率较低等特点。一般选用两种哺乳动物，首选为大鼠，此外可采用小鼠或家兔。 大鼠对大多数外源化学物的代谢过程，基本与人类接近；二是大鼠的受孕率较高，每窝产仔可达812只，易获得所需样本数；三是胎仔大小适中，易观察畸形情况。 缺点是大鼠对外源化学物的代谢速率较快，对致畸物的易感性较低，易出现假阴性结果。同时，大鼠的胎盘结构也与人类有一定差异。 (2)、动物交配处理 选择健康性成熟的末孕产雌雄动物，大鼠体重200250g，小鼠2025g，雌雄按1:1或2:1同笼交配。次日早晨阴道涂片检查精子或检查阴栓，凡发现检出精子或阴栓，即确定为妊娠第0天。将查出的孕鼠按随机分组的原则分组。动物数量：

18、大鼠或小鼠每组1020只， 家兔812只， 接触化学物方式与途径：与人体实际接触情况一致，一般多经口给予，雌鼠妊娠的第715天染毒，常用灌胃方式。试验期间每23天称取孕鼠体重：通过体重变化可观察受试动物的妊娠情况和胚胎发育情况。 (3)、剂量分组 致畸试验中剂量分组是一个极为关键与复杂的问题。一般原则是一方面要求出最大无作用剂量，以及引起致畸的阈剂量，同时还要保持母体生育能力，不致母体大批流产和过多胚胎死亡，也应避免较多母体死亡。 一般高剂量组可选雌鼠LD50的1/5-1/3剂量，低剂量组取1/501/30LD50。的剂量；也可以以亚慢性毒性试验中的最大无作用剂量作为高剂量组，以其1/30作为

19、低剂量组。 最好方法：预试摸剂量。 对照组： 阴性对照(溶剂对照) 阳性对照: 维生素A(l5000IU/kg 乙酰水杨酸(250mg/kg) 敌枯双 五氯酚钠等。(4)、动物剖检剖腹产 在预期分娩前12d处死母鼠进行检查。一般大鼠在受孕后第1920d，小鼠第1819d。称量并记录母鼠最终体重。采用颈椎脱臼法或断头法处死动物。从腹中线剖腹，暴露子宫和卵巢，为胎仔检查做准备 。(5)、胎仔检查 切开左右两侧子宫鉴别并记录每窝胎仔中活胎数、晚期死胎数、早期死胎数、吸收胎数及各种胎仔的特征，并记录编号。 对活胎仔要测量其体重、体长、尾长和性别(生殖突与肛门间距离，雌胎仔约lmm，雄胎仔约2mm)。对

20、大鼠还应取出卵巢、记录黄体数。黄体呈黄色，突起于卵巢表面，呈鱼卵状，可代表排卵数。然后进行胎仔外观畸形检查、内脏及软组织畸形检查和骨铬畸形检查。畸形检查只限于活产胎仔。内脏检查的胎仔需在鲍音氏(Bouin)溶液中固定2周以上，用自来水冲洗固定液后，用切片法检查内脏。而骨骼畸形检查则需经固定、透明和茜素红染色等步骤后，才能迸行。（三）、结果判定：常用的评价指标有:(1)平均着床数（）(2)平均活胎率（）(3)着床后死亡率（）(4)畸胎出现率（）(5)活胎仔平均畸形出现数(6)母体畸胎出现率（） 经统计学处理后，若试验组母体畸胎出现率高于对照组，活胎仔畸形出现率显著高于对照组，而且畸形的出现具有剂量-效应关系时，才能判定外源化学物对受试动物具有致畸作用。 雌鼠LD50致畸指数 最小致畸剂量评定标准：致畸指数10以下为不致畸； 10100为致畸； 100以上为强致畸。（四）、注意事项：1. 雌雄鼠交配后并非全部怀孕，大鼠妊娠率约7090，小鼠妊娠率较大鼠低。2. 不同季节，饲养条件不同，妊娠率亦不同。3. 实验组怀孕率明显低于对照组时，对于“未受孕”的结论，应予谨慎考虑并查明是否因受试物有较强胚胎毒作用而使胚胎流产、早期死亡所致。二、体外致畸作用试验法体外全胚培养器官培养细胞胚