胃癌细胞中DPC4基因失活与启动子区的突变

1、胃癌细胞中DPC4基因失活与启动子区的突变【摘要】目的研究胃癌细胞系中dp4基因表达和启动子区域的突变情况，并分析了两者之间的关系。方法采用rtpr法检测9种胃癌细胞系中dp4基因的表达情况；克隆和测序dp4启动子区域的突变情况；应用tfsearhver.1.3软件分析dp4启动子区域的转录因子结合位点。结果dp4在snu5、snu16、snu484、snu638和kat细胞中表达较高，而在snu216、kn28、kn74和ags细胞中表达较低或缺失。测序结果说明，kn74细胞dp4启动子区域出现了两处碱基置换突变，而在其它8种细胞系中没有发现突变。两处突变可能会影响转录因子zf1和ik2与d

2、p4启动子的结合。结论dp4基因在胃癌中频繁发生失活，而其启动子区域的突变可能是导致其失活的原因之一。【关键词】dp4胃癌启动子突变0引言胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居消化道肿瘤的首位1。目前，随着分子病理学的开展，许多基因，如tp53、kras、erbb2、ksa、eadherin(dh1)和pten，已被发现与胃癌的发生和开展过程亲密相关23。然而，研究说明这些基因的改变并不能完全说明胃癌的演进过程，与胃癌相关的且未被说明的分子事件还很多。最近，有文献报道，位于18号染色体的dp4deletedinpanreatiarina4,dp4基因可能在胃癌的发生开展过程中扮演着非常

3、重要的角色4。dp4基因所编码的蛋白sad4是tgftransfringgrthfatr，tgf信号通路中的一个重要的成员。sad4蛋白在细胞浆内与磷酸化的受体型sad蛋白,即sad2和sad3，形成异源三聚体复合物，然后从胞浆穿梭入细胞核。此复合物在细胞核内作为转录因子调节tgf靶基因的表达，其中包括细胞周期蛋白依赖的激酶抑制基因ylindependentkinaseinhibitrsp15(ink4b)和p21(af1)56，从而抑制了细胞周期的进程。因此，当dp4失活或表达下调时就会促进肿瘤的发生和开展。本课题组前期实验结果说明dp4基因的失活与胃癌亲密相关，且其失活可能是由多种因素共同

4、作用的结果7。zhu等8报道dp4基因启动子区域的突变可能是导致dp4在子宫内膜癌中失活的原因之一，然而对于胃癌细胞中是否存在dp4启动子区域的突变至今还未见报道，为此，我们研究了9种胃癌细胞系中dp4基因启动子区域的突变情况，并分析了dp4突变与基因表达之间的关系。1材料与方法1.1细胞培养在所研究的9种胃癌细胞系中包括6种低分化的细胞系snu5、snu16、snu216、snu484、snu638、ags、2种中等分化的细胞系kn28和kn74和一种印戒细胞癌的细胞系kat，所有细胞均由韩国首尔大学药学院申英基教授馈赠。snu5和snu16细胞为悬浮生长的细胞系，其余为贴壁生长的细胞系。细

5、胞接种在含10%胎牛血清、2谷氨酰胺、100u/l青霉素和100g/l链霉素的rpi1640培养液中，在37，5%2环境下培养。1.2核酸提取采用基因组dna提取试剂盒qiagen,gerany来提取9种传接5代以内的细胞系基因组dna，所有的操作步骤完全参照试剂盒说明书的进展。提取的dna首先要经过琼脂糖凝胶电泳来检测是否有降解成分，合格的再经过紫外分光光度计检测其含量和质量，d值260n/280n在1.8到2.0之间的为质量合格。此外，我们用trizlinvitrgen,usa试剂从细胞系中提取rna，然后利用supersript转录酶、寡核苷酸dt以及随机引物与rna共孵育来进展反转录。

6、整个操作过程完全按照产品说明书执行。1.3反转录聚合酶链反响(reversetransriptinpr,rtpr)采用rtpr的方法来检测9种胃癌细胞系中dp4基因在rna程度的表达情况。详细的引物序列如下：正义引物5atggaaatatgttatta3，反义引物5gttaaaggttgtgggt3，其扩增片断为dp4基因编码区dna的全长。pr反响的条件是：94变性5in，紧接着28个循环的94变性30se，60退火45se和72延伸90se，最后是7210in延伸步骤。pr反响混合物的成分包括：1缓冲液，1.5gl2，10pl双向引物，0.2dntp，1utaqdna聚合酶，dna和相应的

7、双蒸水，反响混合物的总体积为50l，阴性对照为无模版的pr反响。最后利用浓度为1%的琼脂糖凝胶溴化乙锭染色对pr产物进展电泳。所获得的凝胶图像用alaphaiager2200凝胶分析软件进展分析。1.4pr扩增和测序为了检测胃癌细胞中dp4基因启动子区的突变情况，我们对9种胃癌细胞系的该区域进展了pr扩增。详细的引物序列如下：正义引物5aggggtaagagaaaa3，反义引物5gaatgggggttat3，其扩增片断长度为1438bp。pr反响的条件是：94变性5in，紧接着40个循环的94变性30se，60退火45se和72延伸60se，最后是7210in延伸步骤。pr反响混合物的成分同上

8、，模板为100ng基因组dna，反响混合物的总体积为50l。扩增产物首先经过1%琼脂糖凝胶电泳来检测是否有正确条带产生，然后利用试剂盒纯化扩增产物，再将产物克隆到pget质粒，提取质粒后，送到公司进展测序。2结果2.1dp4在胃癌细胞中的表达我们运用rtpr的方法对9种胃癌细胞系中的dp4表达程度进展了检测，gapdh基因作为内参。结果显示，dp4在snu5、snu16、snu484、snu638和kat细胞中表达较高，而在snu216、kn28、kn74和ags细胞中表达较低或缺失，见图1。说明dp4基因失活在胃癌中是一种频繁发生的分子事件。图1dp4在胃癌细胞中的表达情况略fig1expr

9、essinfdp4ingastrianerells2.2胃癌细胞中dp4启动子区域的突变情况为了说明dp4在胃癌细胞中的下调机制，我们应用pr扩增及测序的方法对9种胃癌细胞系中的dp4启动子区的突变状态进展了检测。pr结果显示在所有的9种细胞系中都出现了特异性的条带，这说明在启动子区域没有大片段的插入或缺失突变。测序结果说明，在kn74细胞的启动子区域出现了两处碱基置换突变，突变位点一个在间隔 转录起始位点上游38bp处正义链g或反义链g见图2a，另一个突变位点在转录起始位点上游481bp处正义链t或反义链ag见图2b，而在其它8种细胞系中没有发现dp4启动子区域突变。:signifyutat

10、inpint图2kn74细胞中dp4启动子区域的突变情况略fig2prterreginutatinfdp4geneinkn74ell2.3dp4启动子区域的分析为了讨论这些置换突变的意义，我们又利用tfsearhver.1.3japan等软件对dp4启动子区域进展了分析。分析结果显示，在dp4启动子区域含有多个转录因子结合位点，这包括al1a、az、sp1、lef1、hnf3、zf1和ik2，见图3，而在kn74细胞的两个突变恰好发生在转录因子zf1和ik2的结合位点上，这提示两个碱基置换突变可能通过干扰转录因子的结合而影响dp4基因的转录。3讨论dp4基因是一种经典的肿瘤抑制基因，已有研究说

11、明dp4基因的失活与多种肿瘤的发生开展亲密相关9，然而对其失活机制至今还没有被完全说明。本课题组前期研究说明在胃癌中dp4基因启动子区域的甲基化、染色体的杂合性缺失以及编码区突变都是导致其基因失活的原因之一，但这三种遗传和表观遗传的机制并不能完全解释dp4基因在胃癌中的失活，因为仍有一些胃癌组织在没有发生上述三种现象的同时却发生了基因失活现象7，这提示还有其他的机制参与了dp4基因的失活。zhu等8研究发如今子宫内膜癌中dp4基因启动子区域出现了置换突变，且其突变导致dp4基因的失活，这一研究结果促使我们去讨论是否在胃癌中也发生了类似的现象，即启动子区域的突变也是导致胃癌细胞dp4基因失活的原

12、因。我们首先对9种胃癌细胞系中的dp4的表达程度进展了研究，rtpr结果显示dp4基因在胃癌细胞中频繁发生缺失或表达下调，这一结果与之前的报道根本一致。随后，为了讨论其失活机制我们对dp4基因启动子区域进展了克隆和测序。我们发如今9种细胞中只有一种，即kn74，在dp4启动子区域发生了突变，突变的类型为置换突变，突变点一个位于间隔 转录起始位点上游38bp处正义链g或翻译链g，另一个突变位点在转录起始位点上游481bp处正义链t或反义链ag，而在kn74细胞中的dp4基因恰好发生表达下调，这提示启动子区域的突变可能是导致kn74失活的机制。：signifyutatinpint；：signify

13、transriptinstartsite；:signifytransriptinfatrbindingsite图3dp4启动子区域分析略fig3analysisfdp4prterregin为了更深化的理解dp4基因启动子区域突变与失活的关系，我们对启动子区域的转录因子结合位点进展了分析。结果显示，在dp4启动子区域含有al1a、az、sp1、lef1、hnf3、zf1和ik2等多个转录因子结合位点，而两个置换突变恰好发生在zf1和ik2两个转录因子的结合位点上。zf1是一种2h2锌指蛋白转录因子，研究发现此分子可调节细胞增殖和分化，并参与肿瘤形成10。而转录因子ik2被发现可调节淋巴细胞分化，

14、并可转录激活胰岛素调节的氨基肽酶irap和胎盘亮氨酸氨基肽酶plap等基因11。因此，发生在两个位点的置换突变可能会影响转录因子zf1和ik2与dp4启动子的结合，继而干扰了转录因子的转录激活作用，最终导致dp4基因的失活。总之，本研究首次发现了胃癌细胞中存在着dp4启动子区域的突变，且其突变可能是导致dp4失活的原因之一。然而对于两个置换突变的真正意义还有待于进一步研究阐释。【参考文献】1fuhss,ayerrj.gastriarinaj.nengljed,1995,333(1):3241.2erner,bekerkf,kellerg,etal.gastriadenarina:pathrph

15、lgyandleularpathlgyj.janerreslinnl,2001,127(4):207216.3刘芬,于皆平,邓全军,等.pten在胃癌细胞中的表达及其pg岛甲基化状态的研究j.肿瘤防治研究,2022,33(9):632634.4pells,harperj,hailtnsr,etal.inativatinfsad4ingastriarinasj.anerres,1997,57(19):42214224.5pardalik,kanetz,heldinh,etal.sadpathayspeifitransriptinalregulatinftheellyleinhibitrp21(af1/ip1)j.jellphysil,2022,204(1):260272.6levyl,hills.sad4dependenydefinestlassesftransfringgrthfatrbeta(tgfbeta)targetgenesanddistinguishestgfbetainduedepithelialesenhyaltransitinfritsantiprliferativeandigratryrespnsesj.lellbil,2022,25(18):81088125.7anglh,kish,leejh,etal.inativatinfsad4tursupp