儿童呼吸道常见的细菌培养鉴定技术应用

1、儿童呼吸道常见的细菌培养鉴定技术应用病原菌确定原则自从发现细菌以来，已经确定上百种疾病的病原菌，对这些常见的传染病，通常只要检出已经确定的病原菌，就可以认定这种疾病的原因。新出现的传染病，需要用确定病原菌的古老标准来确定。对病人组织、器官中分离到的一种微生物，不足以说明就是疾病的原因。对于细菌性疾病，需要满足郭霍原则（Koch）。郭霍原则的四个条件从一种疾病病人中能有规律地发现一种细菌；能够分离这种细菌获得纯培养；把这种细菌的培养物引入易感动物体内，可以引起与病人类似的疾病；在实验感染引起的疾病中，仍然能够分了同一种细菌。只有能够满足所有四个条件，才能确定该种细菌室相应疾病的病原。提 纲（一）

2、呼吸道标本的采集。 痰标本是反映下呼吸道感染最直接的标志物，痰标本采集过程污染机会多，痰标本采集方便、无痛苦。（二）合格的痰标本。（三）呼吸道（痰）标本细菌培养存在的问题。（四）呼吸道（痰）标本接种处理。（五）呼吸道（痰）标本细菌报告。（六）肺炎链球菌的分离培养技术。（七）流感嗜血杆菌的分离培养技术。（一）痰标本采集方法：1)自然咳痰：要求患者留痰前用清水漱口3次, 用力咳出。首先用灭菌生理盐水将痰液洗3次，然后将痰块打碎，制成悬液后再接种。2) 采用吸痰器吸痰：吸痰前可以超声雾化、轻拍背部促进患儿排痰。用于新生儿（一）痰标本采集方法：3) 纤维支气管镜抽取法：适用于纤维支气管镜检查或治疗的患

3、者。在肺内病灶附近直接取得的标本无疑是比较理想的标本，但对患者有一定的痛苦。4）压舌取痰法：对于多数小儿可采用此方法。以压舌板向后压舌，用棉拭子伸入咽部，经压舌刺激咳痰时，喷出的肺部或气管分泌物会黏附在拭子上。（二）合格的痰标本。痰标本留取后应先涂片, 进行革兰染色镜检合格后再接种。镜检不合格标本, 应通知临床重新留取标本。痰标本合格的标准： 痰标本 鳞状上皮细 白血球 细菌种类 合格 =10 1-3种 不合格 =25/低倍 3种（三）痰标本细菌培养存在的问题。痰标本不合格：痰标本已被唾液、食物、口腔细菌污染。标本接种不及时：新入院病人用药前采集标本后未及时送检，到下午采集中送检。呼吸道常见细

4、菌如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌等苛养菌是很娇的细菌，如不及时送检这些细菌均会死亡，尤其脑膜炎奈瑟菌需保温送检。标本应在采集后1小时内接种培养。（三）痰标本细菌培养存在的问题。培养基不合格： 肺炎链球菌、化脓性链球菌可以在绵羊血平板上生长，绵羊血不含X因子，所以流感嗜血杆菌、奈瑟菌在绵羊血巧克力平板上生长差或不生长，要加入一种含X因子的添加剂才能生长良好，而马血、兔血同时含有V和X因子，所以采用马血或兔血制的巧克力平板，流感嗜血杆菌、奈瑟菌生长良好。痰标本的培养时间： 呼吸道(痰)标本培养应该为2472小时。24小时培养后细菌生长稀少或未生长的平板应继续培养到72小时后再作报告，防止

5、一些生长缓慢的细菌会遗漏，如卡他莫拉菌、奴卡菌、嗜血杆菌等。（三）痰标本细菌培养存在的问题。（四）呼吸道（痰）标本的接种处理涂片革兰氏染色，观察痰标本是否合格。血琼脂：哥伦比亚琼脂或胰大豆胨琼脂、5绵羊血、或加适量抑制剂如庆大霉素有利于肺炎链球菌生长。巧克力琼脂：哥伦比亚琼脂+5马血或兔血+3mg/100mL去甲万古霉素或杆菌肽，有利于嗜血杆菌的分离培养。(五)痰标本致病菌的选择和报告占一定优势并已明确的致病菌：金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、-溶血性链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、隐球菌等。对溶血葡萄球菌、其他嗜血杆菌如占70%或以上量时，也应报告给临床医生参考。优势菌：阴性杆菌占50%量或以

6、上时，应报告。(五)痰标本致病菌的选择和报告草绿色链球菌、奈瑟菌、类白喉、凝固酶阴性葡萄球菌、副流感嗜血杆菌等无充分理由，不应作为致病菌报告。除呼吸道正常菌群外多于3种或以上细菌时，要考虑痰标本的口腔污染。卡它莫拉菌识别：* 可在血琼脂或巧克力上生长* 灰略黄、干燥但可在盐水中乳化，可用接种环推动整个菌落。（六）肺炎链球菌培养技术前 言肺炎链球菌(Streptococcus pneumoconia，SP)是儿童和成人肺炎的重要病原菌之一，存在于正常人口腔、鼻咽部，在机体抵抗力下降时致病。在儿童中可引起肺炎、中耳炎、乳突炎、鼻窦炎、细菌性脑膜炎、败血症等疾病，尤其对婴幼儿构成严重威胁。国外概况在

7、美国，每年侵袭性SP感染的发生率为72-103/10万儿童，而欧洲为10-24/10万儿童/年。每年约有600多万例中耳炎由SP引起，占急性中耳炎30-50；在发展中国家，每年约有500万5岁以下儿童死于SP引起的肺炎，10-50万儿童死于SP引起的脑膜炎。国内概况：国内最早儿童肺炎链球菌脑膜炎个案报告在1942年。60年代中期以前研究资料显示SP肺炎、脑膜炎在冬春季发病较多，是儿科住院病人中常见病例多发生在婴幼儿。SP性脑膜炎占化脑的，仅次于流脑。SP也是小儿肺炎的重要病原菌之一，SP所致大叶性肺炎，5岁以下儿童中可占70。国内概况：80年代后的研究资料显示SP脑膜炎占同期化脑的。SP引起的

8、败血症还是少见，约占5左右。一项13岁以下儿童中耳炎病原学研究显示SP引起的感染占病例，是最常见的病原菌。本院情况我院2006年参与惠氏中国住院儿童肺炎流行病学调查研究，从入选的1097例肺炎住院儿童的痰标本中检出肺炎链球菌79例，检出率为7.2%。近三年，我院肺炎链球菌检出458多株，其中呼吸道331株，耳分泌物85株，血液检出18株，脑脊液检出11株，胸积液5株，其他部位（外阴部、皮肤创伤浓液等）检出8株。肺炎链球菌的致病力SP的荚膜在细菌的侵袭力上起主要作用，有荚膜的SP有毒力，失去荚膜则独力减低或丧失。还可产生溶血素、紫斑产生因子、杀细胞素、皮肤致死毒素等。根据SP荚膜多糖抗原的不同可

9、分为90个血清型，与疾病相关的血清型分布随时间、地点、年龄不同而变化。标本来源 根据不同病因可采集痰、肺泡灌洗液、脓液、耳分泌物、外阴分泌物、胸腔积液、脑脊液和血液等标本。痰应采用深部咳出的，选择铁锈色部分或脓性分泌物。培养基血琼脂平板：胰大豆蛋白胨琼脂或哥伦比亚琼脂加5%绵羊血；加庆大霉素的血琼脂平板：在普通血琼脂中加入抑制剂庆大霉素注射液，混匀倾倒平板，琼脂中庆大霉素最后浓度相当于1.25 mg/250mL。标本接种及培养条件用鼻咽拭子采取患儿鼻咽分泌物、痰、咽拭子、肺泡灌洗液等呼吸道标本接种庆大霉素血平板或普通血平板，置于35，5CO2温箱培养18-24小时。初次分离培养在510%的CO

10、2条件下生长良好。血液、脑脊液标本用血培养基增菌后转种庆大霉素血平板或普通血平板置于355CO2温箱培养18-24小时。菌落特点：在血琼脂平板形成细小、圆形、中央脐窝状、表面光滑、草绿色、扁平周围有草绿色溶血环的直径的菌落。典型的SP菌落圆形、呈脐窝状、较湿润、边缘整齐。不典型的SP菌落有水滴样，菌落较大，边缘不整齐；还有细小、似草绿色链球菌但较湿润的菌落也需注意。细菌染色形态革兰氏染色阳性，呈矛头状，成双或链状排列，有荚膜；在痰标本中大多数成双排列。鉴定要点：Optochin敏感，胆汁溶菌和荚膜肿胀试验阳性，菊糖分解试验阳性，小鼠毒力试验阳性。Optochin（乙基羟化奎宁）试验： 将被检菌

11、的肉汤培养液均匀涂布于血琼脂平板，贴Optochin纸片经35培养1824小时，抑菌环直径14mm为敏感。 注意：近年有报道OP耐药的肺炎链球菌。 2009年的全国质控有一株菌就是OP耐药的肺炎链球菌。胆汁溶菌试验：平板法：取10去氧胆酸钠1接种环，加于血琼脂平板的被检菌上，35孵育30分钟，菌落溶解消失为阳性；试管法：在隔夜培养液中加入去氧胆酸钠溶液，37水浴1030分钟，培养液由浊变清为阳性。用生理盐水代替去氧胆酸钠溶液作阴性对照。肺炎链球菌药敏试验方法阿莫西林、青霉素、头孢曲松、头抱呋辛、头孢克洛、头孢噻肟、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南是用于治疗肺炎链球菌感染的常用药物，根据CLSI文件

12、，肺炎链球菌药敏必须采用MIC法。目前我们采用的MIC法有E-Test法和仪器法。肺炎链球菌药敏试验方法：E-Test法：培养基采用M-H琼脂+5脱纤维绵羊血， E-Test试验条采用瑞典AB-Biodisk公司产品，菌液调麦氏单位，涂布平板，9cm平板贴两条纸片，相反方向贴，12cm平板可以贴5条纸片，低浓度相向贴， 355CO2温箱培养20-24小时看结果，操作及结果判断参照产品说明书。仪器法：梅里埃公司的VITEK-2-COMPACT，GP-68卡片是肺炎链球菌专用卡片。肺炎链球菌的耐药机制SP不产生-内酰胺酶，对青霉素和头孢菌素耐药性非质粒介导，而是通过一系列PBP靶位自身改变，与抗生

13、素的亲和力下降所致，即-内酰胺类抗生素通过-内酰胺环与PBPs的丝氨酸活化位点共价结合使之失去活性，从而阻断细菌细胞壁合成，发挥杀菌作用，产生耐药的主要机制。肺炎链球菌的耐药机制SP对大环内酯类抗生素的耐药主要是由于核糖体靶位的改变、主动外排机制增强及产生修饰酶灭活药物。本地耐药情况和趋势： 20062009年资料显示：广州地区儿童PRSP低于匈牙利、韩国、台湾，与香港接近，高于上海、北京，广州地区儿童鼻咽部肺炎链球菌对青霉素的耐药性不高，主要表现为中介，CLSI修改前2006年的PRSP水平为11.2%，中介为77.2%，2008年修改后PRSP 水平更低。本地耐药情况和趋势： SP对大环内

14、脂类抗生素的耐药情况较为严重，其中红霉素的耐药率达80.5%， 且多数为高水平耐药， 其中59%的菌株MIC为256g/ml，其耐药情况与杭州地区的红霉素的耐药率90.1%、74%的菌株MIC为256g/ml比杭州地区要低，大环内酯类抗生素的广泛使用可能是造成其耐药率增加的重要原因。本地耐药情况和趋势： 20062009年资料耐药性显示，SP对三代头孢类抗生素和青霉素加酶抑制剂药物的耐药性较低，阿莫西林/克拉维酸、头孢曲松分别为0和3.8%，一代头孢菌素头孢呋辛的耐药率为72.2%。本地耐药情况和趋势： SP对红霉素、四环素、复方新诺明、克林霉和氯霉素的多重耐药情况较为严重，多重耐药发生率为7

15、5%，高于北京、上海、杭州地区。本地耐药情况和趋势： 结 论： 广州地区临床治疗儿童SP感染应首选青霉素加霉抑制剂的复合药物或三代头孢菌素。SP血清学分型：肺炎链球菌的血清分型可以为肺炎链球菌疫苗研究提供可靠依据，也是一种流行病学调查手段。肺炎链球菌的抗原成分较多，有菌体核蛋白、菌体种属特异性抗原、荚膜多糖抗原等。SP血清学分型荚膜多糖抗原：亦称型特异性抗原，存在于肺炎链球菌的荚膜中，由大量多聚体组成，能溶于水，有型特异性，故称之为可溶性特异性物质（SSS）。不同菌株所含荚膜多糖不同，故可用凝集、沉淀和荚膜肿胀试验，进行肺炎链球菌分型。目前至少可将有荚膜的肺炎链球菌分成83个血清型。SP血清学

16、分型：荚膜肿胀试验乳胶凝集试验两种试剂均购自丹麦我们实验室采用荚膜肿胀试验SP血清学分型步骤：1 细菌复苏：将肺炎链球菌冻沉管从-70冰箱取出，挑取3-5l菌液接种于普通羊血培养基，35、5%CO2培养18-24小时，挑取单个菌落做次代培养。2 配制PBS溶液，并分装小试管，每管约，用亚甲蓝粉配制的亚甲蓝试剂。SP血清学分型步骤：3 用接种环挑取经次代培养后的肺炎链球菌菌落，放入小试管中，制成菌悬液约麦氏单位浓度。4 用接种环挑取约10l菌悬液放入载玻片上，再挑取同量的诊断血清（10l）放入载玻片上，并与菌悬液搅拌混匀。SP血清学分型步骤：5 再加入一环的亚甲蓝试剂放入载玻片上与抗血清混匀一分

17、钟，或盖上盖玻片，在显微镜下是否有荚膜或凝集出现。6 出现凝集或荚膜肿胀的抗血清型即为该肺炎链球菌的血清型。常见的血清型：常引起人类疾病的血清型20多种，最常见的血清型有：6B、9V、14、19A、19F、23F。国内儿童流行的主要是：6A、6B、23F、19F、14、4、不定型。肺炎链球菌血清型流行趋势肺炎链球菌的血清型分布随国家和年龄组的变化不大，欧洲国家和美国有着相似的血清型分布，美国的常见血清型依次为6B、19F、23F、14、18C，荷兰常见的血清型分布依次为19F 、6B、6A、9V、23F。亚洲的情况略有不同，韩国以15、14、6B、19F较普遍，而印度以6、14、19、15型较

18、多见。国内儿童的血清型流行情况：地区标本 对象常见血清型北京痰、肺泡灌洗液、胸积液5岁以下肺炎住院儿童6A、23F、6B、19F、14、不能分型上海同上同上6A、6B、19F、23F广州（本院）同上同上6A、23F、19F、15B、4、6B、不能分型深圳同上同上23F、19F、15B、4、19A、15B7价疫苗和13价疫苗比较7价疫苗： 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F。13价疫苗： 以上7价+1, 3, 5, 6A, 7F, 19A。疫苗涵盖（100）地区7价疫苗13价疫苗北京3570上海7889广州9797深圳8793结论广州地区肺炎住院儿童感染SP对大环内酯类药物

19、红霉素和林可酰胺类药物克林霉素的耐药情况严重，对阿莫西林、三代头孢菌素等-内酰胺类耐药性较低，临床治疗儿童SP感染所致肺炎应首选阿莫西林、三代头孢菌素。结论广州地区致儿童肺炎的肺炎链球菌90%以上包涵在7加疫苗内，要预防肺炎链球菌感染所致肺炎，采用7价疫苗可以达到很好的效果。（七）流感嗜血杆菌培养技术前 言 流感嗜血杆菌(aemophilus influenzae, Hi)，俗称流感杆菌。1892年流感世界大流行时，波兰细菌学家Pfeiffer首先从流感患者鼻咽部分离出一种革兰氏阴性小杆菌，当时认为此菌便是流感的病原体，由此而得名。 流感嗜血杆菌的致病性HI主要引起人类急性化脓性感染，是急性咽

20、炎、喉炎、支气管炎、急性鼻窦炎、中耳炎、生殖道感染及产后菌血症的主要致病菌之一，尤其是社区获得性肺炎的重要病原菌，还可以引起化脓脑膜炎、败血症、新生儿脓毒血症等侵袭性感染，也可继发于流感、麻疹、百日咳、肺结核等呼吸道感染。毒力因子：荚膜、菌毛、IgA1蛋白酶、血素（Haemocin）其中PRP荚膜是主要的毒力因子。标本接种处理痰、咽拭子、血（增菌后）、分泌物、脑脊液等标本划线接种于流感嗜血杆菌选择性培养基，放入5CO2培养箱3537孵育1824h,菌落细小，可延长培养时间至48小时。培养特性营养要求比较特别，需要、因子存在及510%的CO2气体，最适生长温度37。培养基采用哥伦比亚琼脂加5%马

21、血或兔血制成巧克力琼脂，加入去甲万古霉素注射液或杆菌肽作为抑制剂，终浓度分别为6mg/300mL 、76mg/250mL。采用绵羊血做巧克力时，需加入添加剂（OXOID公司产品，剂量按产品说明书）。 流感嗜血杆菌的纯培养形态未加添加剂的平板上，菌落细小，无色透明，边缘整齐，露滴状。加添加剂的平板上菌落较大，灰白色，湿润，边缘整齐。HI染色形态特征流感嗜血杆菌为革兰氏阴性细小杆菌，从病灶中分离的菌株多呈球杆状或双球状，有时可呈短链；在陈旧培养物中成多形态性，有长杆状和丝状；无芽孢、无鞭毛。纯培养物镜下形态HI镜下为革兰氏阴性短小杆菌，多形态性 鉴定方法X、V因子需求试验：取无色透明，边缘整齐，露

22、滴状菌落在哥伦比亚琼脂平板上均匀密划线，在划线上贴X、V因子纸片，两纸片间距为2022mm。经 5CO2培养箱，3537孵育1824h，在两纸片中央出现细小菌落生长现象为阳性。卫星试验：取无色透明，边缘整齐，露滴状菌落在普通血平板上均匀密划线阳性，在划线上点种金黄色葡萄球菌，经 5CO2培养箱，3537孵育1824h，在金葡菌落周围有菌落生长，近端菌落大，远端菌落越来越小，即为阳性X、V因子需求试验或卫星试验阳性即可鉴定为Hi。流感嗜血杆菌药敏试验：K-B法和Etest法，培养基采用专用流感嗜血杆菌药敏培养基（Heamophilus test medium base HTM）。HI耐药机制:H

23、I对氨苄西林的耐药机制与-内酰胺酶的产生密切相关， Hi产生的内酰胺酶主要是由质粒介导的TEM-1型酶,其次为ROB-1型酶。早在1994年Tenover等研究表明对于编码TEM-1酶的耐药基因主要位于质粒pBR322上或转座子A上,而编码ROB-1酶的耐药基因位于的pROB质粒上。HI耐药机制:相关研究显示头孢洛克耐药的产酶菌株中ROB-1占66.7%，TEM-1占33.3%，并且研究中ROB-1对头孢呋辛、头孢噻肟、头孢克肟和亚胺培南的敏感性与TEM相似。HI耐药机制:-内酰胺酶阴性的耐药菌株(Bata-lactamase-negative and ampicillin-resistanc

24、e ,BLNAR)在 1980 年首次被报道 ,其不产酶耐药机制主要是由于菌株细胞壁上一种或多种青霉素结合蛋白(BPB)发生改变 ,引起青霉素结合蛋白与靶位亲和力的降低 ,其次是由于外膜蛋白改变导致耐药。国外研究情况:Scriver报道氨苄西林耐药的HI 93产TEM-1型-内酰胺酶，只有7产生 ROB-1型-内酰胺酶，没有一株菌同时产生两种酶，两种酶对-内酰胺类抗菌药物的耐药表型是不同的。Karlowsky等研究发现对头孢克洛耐药的产酶HI 66.7%产生TEM-1型-内酰胺酶，产生ROB-1型-内酰胺酶。 国外研究情况:Kim IS, Ki CS等研究证实，韩国流行的菌株携带TEM-1型-内酰胺酶耐药株的BLNAR株和的-内酰胺酶阳性的阿莫西林/克拉维酸耐