细胞松弛素B对小鼠成熟卵母细胞玻璃化冷冻的影响

1、细胞松弛素B对小鼠成熟卵母细胞玻璃化冷冻的影响唐宇铃，丘 彦，幸贵邦，孟江萍 （重庆医科大学附属第一医院辅助生殖中心,重庆 400016）【摘 要】目的：探讨细胞松弛素B（cytochalasin B，CB）对小鼠成熟卵母细胞玻璃化冷冻、受精及胚胎发育的影响。方法：将小鼠成熟卵母细胞分别经过细胞松弛素B浓度为0（对照）、5、10、20、40ug/ml预处理后玻璃化冷冻，解冻后进行体外受精，观察卵母细胞的复苏率、受精率、6-8cell胚胎形成率。结果：20ug/ml组复苏率高于各组（P0.05），但与5ug/ml组比较无统计学差异（92.6% vs 88% ，P0.05）；20ug/ml组受精率

2、高于各组（P0.05），与对照组无统计学差异（68.0% vs 55.9% ，P0.05）；40、20ug/ml组6-8cell胚胎形成率高于各组（P0.05），40ug/ml组与20ug/ml组无显著差异（69.0% vs 64.7%，P0.05），20ug/ml组与对照组差异不显著（64.7% vs 47.4%，P0.05）。结论：CB对小鼠成熟卵母细胞的复苏率、受精率和胚胎形成率具有改善作用。【关键词】细胞松弛素B；成熟卵母细胞；玻璃化冷冻【中国图书分类法分类号】R321.1 【文献标识码】A 【收稿日期】2010-12-24Effects of Cytochalasin B on Vi

3、trification of Mice Mature OocytesTANG Yuling,et al (Assistant Reproductive Centre,the First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University)【Abstract】Objective:To observe the effects of cytochalasin B on vitrification, fertilization and embryonic development of mice mature oocytes.Methods: Mice ma

4、ture oocytes had been cultured with cytochalasin B of different concentrations ,0 (control), 5,10,20,40ug/ml,respectively,and then vitrificated. After thawed, we observed the oocytes recovery rate,fertilization rate, embryo formation rate of 6-8cell.Results: The 20ug/ml concentration of CB group had

5、 higher recovery rate than other group(P0.05),but no significant differences with the 5ug/ml group（92.6% vs 88% ,P0.05）; The 20ug/ml concentration of CB group had higher fertilization rate than other group（P0.05）, but no significant differences with the controlded group（68.0% vs 55.9% ,P0.05）;The 40

6、,20ug/ml concentration of CB group had higher embryo formation rate of 6-8cell than other group（P0.05）,but the 40ug/ml concentration of CB group was no significant differences with the 20ug/ml group（69.0% vs 64.7%,P0.05）,the 20ug/ml concentration of CB group compared to the controlded group was sign

7、ificantly indifferent（64.7% vs 47.4%,P0.05）.Conclusion: The cytochalasin B can be used to improve the recovery rate,fertilization rate and embryos formation rate of mice mature oocytes.【Key words】Cytochalasin B;Mature oocytes; Vitrification 自1999年Kuleshova1等首先报道，应用玻璃化冷冻人第二次减数分裂中期（M）卵母细胞获得成功妊娠和分娩以来，卵

8、母细胞玻璃化冷冻已成为近年来研究的热点和难点。通过冻卵，可以在体外受精-胚胎移植中保存剩余的卵备用，提高辅助生殖技术的效率,为切除卵巢、放疗或化疗的妇女保存生育能力,建立卵子库以简化供卵过程,避免胚胎冷冻引起的归属权的争议。目前，冷冻损伤仍是卵母细胞冷冻保存的主要障碍。Fabbri等2研究发现冷冻常会使卵母细胞胞膜不完整，透明带变硬，细胞骨架破坏，以及染色体异常等。如何减轻卵母细胞的冷冻损伤是提高冻卵技术的一个难题。CB是从真菌中分离得到的代谢产物，是一种细胞骨架的可逆性稳定剂，通过中断微丝之间的联系降低微管在冷冻过程中的损伤3。CB作为冷冻保护剂，可增加细胞骨架弹性和纺锤体微管的稳定性，减轻

9、卵母细胞冻融过程中引起骨架变形和损伤4。本课题以小鼠成熟卵母细胞为模型，研究不同浓度的CB对玻璃化冷冻卵母细胞的影响，探讨CB是否能减少冷冻损伤，提高卵母细胞的复苏率、受精率和后期发育潜能。作者介绍：唐宇铃(1980- )，女，硕士，研究方向：生殖内分泌与辅助生殖技术。通讯作者：丘 彦，女，教授，E-mail：1 材料与方法1.1 实验动物清洁级昆明雌性小白鼠30只，68周，体重2535g,用于获取成熟卵母细胞；清洁级昆明雄性小白鼠10只，812周，体重3545g，用于获取精子，均购自重庆医科大学实验动物中心。1.2 主要仪器和试剂 CO2培养箱（Li Shen，中国），解剖显微镜（Leica

10、，德国），倒置显微镜（XDS-1,中国），SAGE玻璃化冷冻和解冻试剂盒、体外受精（in vitro fertilization,IVF）液（深圳市金协和医疗器械有限公司），细胞松弛素B（美国Sigma公司）。成熟卵母细胞的获取雌性小白鼠腹腔注射10IU尿促性素，48h后注射10IU绒促性素，注射绒促性素后1314h颈椎脱臼处死小鼠，剖腹取出输卵管，在显微镜下，收集形态正常、有第一极体排出的卵母细胞移入IVF培养液，放入CO2培养箱备用。共收集到成熟卵母细胞536个。1.4 细胞松弛素B对小鼠成熟卵母细胞冻融效果的影响实验分为5组，1组为对照组，对卵母细胞直接进行玻璃化冷冻；2、3、4、5组分

11、别经过CB浓度为5、10、20、40ug/ml预处理20min后再进行玻璃化冷冻。1.5 卵母细胞玻璃化冷冻和解冻将卵母细胞放入20l平衡液（Equilibration Solution,ES）进行预平衡10分钟，然后依次转入玻璃化冷冻液 (Vitrification Solution,VS) VS1 5秒，VS2 5秒，VS3 10秒，最后转入VS4液滴，并在90秒内装入麦管投入液氮。解冻时将麦管浸入1M解冻溶液（Warming Solution,WS），卵母细胞逸出后停留1分钟，然后依次移入0.5M WS1、0.5M WS2、0.25M WS3液滴，各停留2分钟,再将卵母细胞依次经过缓冲溶

12、液（MOPS Solution,MS）MS1、MS2、MS3处理，各停留3分钟,最后移入IVF培养液并放入CO2培养箱培养2h后观察卵母细胞存活情况。1.6 复苏后卵母细胞存活的评定透明带完整，质膜无破裂，胞质无外流，折光性好，第一极体完整且呈圆形，卵周间歇存在并且均匀。1.7 体外受精雄性小白鼠分离附睾尾和输精管后，从输精管中挤出精子，放入CO2培养箱中获能1h。制作受精滴，密度约为2106个/ml，将受精培养皿放入培养箱中静置46h后观察有无双原核形成及第二极体释放5。受精后2448h观察24cell胚胎数量，4872h观察68cell胚胎数量。1.8 统计学分析 采用SPSS 17.0进

13、行卡方（X2）检验，P0.05表明差异有统计学意义。2 结 果2.1 细胞松弛素B对解冻后卵母细胞复苏率的影响 CB浓度为5、20、40ug/ml组复苏率高于对照组，10ug/ml组低于对照组，且CB浓度为20ul/ml组差异有显著性（P0.05）。CB各浓度组间具有统计学（P0.05），两两比较CB浓度为5ug/ml组复苏率高于10ug/ml组（P0.05）、40ug/ml组（P0.05），低于20ug/ml组（P0.05）；20ug/ml组高于10、40ug/ml组（P0.05）；40ug/ml组高于10ug/ml组（P0.05）。（见图1、表1）。存活卵母细胞（400倍）异常卵母细胞（4

14、00倍）受精卵母细胞（400倍）图1 解冻后成熟及受精的卵母细胞形态2.2 细胞松弛素B对卵母细胞受精率的影响 CB浓度为20ug/ml组受精率高于对照组，CB浓度为5、10、40ug/ml组受精率低于对照组，但均无显著性差异（P0.05）。CB各浓度组间具有统计学（P0.05），两两比较CB浓度为20ug/ml组受精率高于5、10、40ug/ml组（P0.05）；10、40ug/ml组高于5ug/ml组（P0.05）；10ug/ml组高于40ug/ml组（P0.05）。（见图1、表1）。2.3 细胞松弛素B对卵母细胞6-8cell胚胎形成率的影响 CB浓度为20、40ug/ml组6-8cel

15、l胚胎形成率高于对照组，且CB浓度为40ul/ml组差异有显著性（P0.05）。CB各浓度组间具有统计学（P0.05），两两比较CB浓度为20、40ug/ml组胚胎形成率高于5、10ug/ml组（P0.05），40ug/ml组高于20ug/ml组（P0.05）；10ug/ml组高于5ul/ml组（P0.05）。（见图2、表1）。表1 细胞松弛素B对小鼠成熟卵母细胞冻融的影响组别：CB浓度（ug/ml）取卵数（M期）复苏率（%）受精率（%）6-8cell胚率（%）08868（77.3）38（55.9）18（47.4）510088（88.0）36（40.9）d14（38.9）de1011276（6

16、7.9）bd36（47.4）d16（44.4）de20108100（92.6）a68（68.0）44（64.7）40128100（78.1）d42（42.0）d29（69.0）a注：a P0.05，与对照组比较；b P0.05，与5ug/ml组比较；c P0.05，与10ug/ml组比较；d P0.05，与20ug/ml组比较；e P0.05，与40ug/ml组比较2cell（400倍）4cell（400倍）8cell（400倍）图2 体外受精后胚胎的2-8cell形态3 讨 论1986年Chen6报道第一例冻融人卵母细胞成功以来，2008年国内外仅有900多例冻卵胎儿出生的报道7 ，卵子冷冻

17、尚未常规运用于临床。Borini8等2004年报道慢速冷冻人772枚卵子，解冻737枚卵子中有273枚存活(37%)，经ICSI受精124枚(45.4%)。2009年田秀朱9等报道采用不同蔗糖浓度(0.1、0.2、0.3mol/L)的冷冻保护剂程序化冷冻205枚人卵母细胞，复苏后的存活率分别为23.1%、40.8%、59.4%。陈子江10等2006年报道玻璃化冷冻235个人卵母细胞，解冻后存活169个（71.9%），ICSI受精122个（72.2%）。有研究指出卵母细胞是人类最大的细胞，表面积与体积比值小11，妨碍了卵膜水与冷冻保护剂的交换，冷冻过程中细胞骨架的易受损伤性，解冻后的复苏率不高。

18、细胞骨架是由微管、微丝和中间纤维组成，分布于整个细胞质中。微管组成的纺锤体装置是一个功能性组织，促进染色体在分裂过程中分离及第一和第二极体的排出，确保正常的染色体分离避免非整倍体12。徐千花13等2009年通过激光共聚焦显微镜下观察玻璃化冻溶后人成熟卵母细胞的纺锤体及染色体形态正常率与未冷冻组相比差异具有显著性，冷冻组21个，正常5个（24%），未冷冻组26个，正常16个（62%）。成熟卵母细胞的染色体附着于第二次减数分裂纺锤体易变的微管上，纺锤体对低温敏感，冷冻过程易导致微管解聚、染色体弥散，存活率、受精率和后期发育潜能降低14。因此，提高细胞骨架在玻璃化冷冻过程中的稳定性，将有可能提高卵母

19、细胞冷冻的存活率、受精率以及发育潜能，减少冷冻损伤。已有研究指出细胞松弛素B可以减弱细胞骨架基础的坚固性，增加细胞柔韧性，减少冷冻对细胞骨架的损伤。动物实验中的显微操作采用CB进行预处理的研究虽多，有效性尚有争议。2004年Fujihira15等发现在猪胚胎玻璃化冷冻中添加细胞松弛素B，可显著提高囊胚的生存和发育。2004年朱德生16等报道在核移植过程中用CB处理小鼠卵母细胞能使细胞结构变得松弛，减少去核操作时对受体胞质的损伤，采用10ug/ml的CB预处理后去核率88.2%（270/306），无CB预处理组去核成功率29.7%（38/128）。2008年崔龙波17等在核移植过程中用CB浓度5

20、40ug/ml处理小鼠卵母细胞,通过激光共聚焦扫描显微镜观察纺锤体结构未见异常。Somfai等18 2006年报道CB提高了玻璃化冷冻猪成熟卵母细胞的存活率和发育率。但张波等19 2007年用5ug/mlCB预处理M期小鼠卵母细胞351枚后进行玻璃化冷冻，解冻后观察存活率、受精率、卵裂率及囊胚率，未证实其具有保护作用。2008年张家新等20采用2.5、5.0、7.5和10ug/mlCB预处理绵羊成熟卵母细胞597枚，经过玻璃化冻融后存活率、卵裂率、囊胚率均显著低于对照组。这些是否属于物种间或方法学的差异尚需进一步研究。 本实验以昆明小鼠为模型，采用成倍递增方式设置了4个CB浓度处理组。通过解冻

21、后卵母细胞复苏率及受精率显示，CB浓度为20ul/ml组高于各组，且复苏率与10、40ug/ml、对照组具有显著差异（P0.05），受精率与5、10、40ug/ml组具有显著差异（P0.05）；CB浓度为40、20ug/ml组6-8cell胚胎发生率高于各组，40ug/ml组与20ug/ml组无显著差异（69.0% vs 64.7%，P0.05），20ug/ml组与对照组差异不显著（64.7% vs 47.4%，P0.05）。由此可见CB在一定程度上能够降低细胞骨架对冷冻损伤的敏感性，对骨架成分具有特定的可逆性作用，提高细胞中这些成分的柔韧性，特别是浓度为20ug/ml的CB减轻冻融对小鼠卵母

22、细胞的损伤，提高存活率及胚胎的后期发育潜能具有很好的促进作用。本实验提示CB在小鼠成熟卵母细胞的玻璃化冷冻过程中具有一定的冷冻保护作用，但CB在人卵母细胞冷冻中的作用报道较少，最佳处理时间和浓度有待进一步的研究和探索。 参考文献1 Kuleshova K,Gianaroli L,Magli C,et al.Birth following vitrification of a small number of human oocytes:case reportJ.Hum Reprod,1999,14:3077-3079.2 Fabbri R,Porcu E,Marsella T,et al.Tec

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