蛋白质定性定量检测

1、第五章 蛋白质的定性定量检测1第一节 免疫组织化学的基本理论第二节 蛋白质的定量检测第三节 免疫印迹法分析特定蛋白质的相对含量第四节 酶联免疫吸附试验（ELISA）2一、形态学研究的方法（S）二、组织化学三、免疫组织化学第一节 免疫组织化学的基本理论3一、形态学研究的方法（S）（一） 普通光镜术（二）特殊光镜术1. 荧光显微镜2. 相差显微镜3. 暗视野显微镜 4. 激光扫描共聚焦显微镜（三）电镜术1. 透射电镜术 2. 扫描电镜术 3. 冷冻蚀刻术（四）组织（细胞）化学术（五）免疫组织(细胞)化学术（六）原位杂交（七）细胞培养术（八）活体与活细胞染色（九）形态研究的定量术41. 常规方法：苏

2、木素（Hematoxylin）-伊红（Eosin）染色法/HE染色2. 特殊染色:（一）普通光镜术（S）5HE染色6心肌细胞光镜图7小脑皮质神经元镀银染色8（二）特殊光镜术（S）9始自于上世纪八十年代的，采用共聚焦显微成像的原理，在荧光显微成像的基础上加装了激光扫描装置，再利用计算机进行图像处理。可对组织细胞内部进行立体断层扫描，达到了动态观察的一种全新的技术。有细胞CT之称。激光扫描共聚焦显微镜技术10（三）电镜术（S）1. 透射电镜术 2. 扫描电镜术 3. 冷冻蚀刻术11浆细胞透射电镜图12血细胞扫描电镜图13（四）组织（细胞）化学术14（五）免疫组织（细胞）化学术15（六）原位杂交（S

3、）探针：DNA、RNA、寡核苷酸（ODN）标记物：放射性核素；非放射性显示：放射自显影；免疫组化 16（七）细胞培养术（S）17（八）活体与活细胞染色（S）181. 形态计量术（体视学）2. 显微分光光度术 3. 图像分析术 4. 流式细胞术（九）形态研究的定量术（S） 19二、组织化学（histochemistry）组织化学（histochemistry）：以组织学为基础，应用物理和化学的技术方法显示细胞组织结构中的各种化学成分，并对这些物质进行定位、定性和定量，从而分析研究生物体在生理或病理状态下细胞和组织代谢、功能及形态变化规律的科学。20细胞化学技术能够对细胞内的各种成分进行定性、定位

4、、定量研究，包括悬浮胸腹水细胞、血液细胞以及体外培养细胞均能产生同样良好的效果。目前，用细胞化学技术所能显示的化学成分有蛋白质（显示某些特定蛋白、某些氨基酸或功能基）、RNA、DNA、糖类（如糖原、粘多糖和糖脂等）、脂类（如中性脂肪、磷脂和固醇等）、酶（如磷酸酶）、特异抗原（其化学本质可能是多肽、蛋白、糖蛋白等）、无机盐和微量元素（如铁、铜、锌、镁等）。 细胞化学技术（S）21细胞化学染色（S）原理：细胞中的化学成分和其相应的底物呈一系列的化学反应，形成于显微镜下可见到的反应产物。常见的有：1. 孚尔根反应法（Feulgen reaction）：显示DNA呈现紫红色。2. 甲绿-派郎宁法（Me

5、thyl Green-Pyronin method）：显示核酸（甲绿染DNA呈现绿色，派郎宁染RNA呈现红色）。3. 苏丹冰冻切片染色：显示中性脂肪呈现橘红色。4. 普鲁士蓝反应：显示组织中含铁血黄素。5. 过碘酸雪夫反应（Periodic acid schiff reaction，PAS）：显示糖原和其它多糖物质为紫红色。 22PAS23苏丹染色24三、免疫组织化学（immunohistochemistry）（一）免疫组织化学的概念（二）免疫组织化学的简要步骤（三）抗原-抗体反应（四）免疫标记化学反应与检测（五）常用免疫组织化学染色方法（六）免疫组组织化学在临床病理诊断中的应用（S） 25免

6、疫组织化学：免疫学与组织化学相结合的一个分支学科，以免疫学的抗原-抗体反应为基础的理论，其可作为蛋白质定位、定性及半定量检测的方法之一。免疫组织化学已被广泛应用于基础科学研究和临床诊断中。（一）免疫组织化学的概念26（二）免疫组织化学的简要步骤1. 抗体（anbibody，Ab）的制备（1）抗原的提取和纯化（2）免疫动物制备多克隆抗体或细胞融合制备单克隆抗体（3）抗体效价检测和纯化（4）标记复合物的制备2. 抗原（antigen，Ag）的检测（1）细胞或组织切片的制备（2）免疫组织化学反应和显色3. 结果观察和记录27抗原的提取与纯化免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化标记物复合物的制备标

7、本的处理抗原抗体反应和呈色反应观察和记录结果28（三）抗原-抗体反应抗原-抗体反应：由抗原物质刺激机体产生相应的特异性抗体后，抗原和其特异性的抗体在体内或体外发生结合反应的过程。29利用抗原、抗体在体外可以发生特异性结合反应的特点，将其应用到细胞组织化学中，可对各种抗原或生物活性物质进行分离及检测。30（四）免疫标记化学反应与检测免疫标记化学反应：用荧光素等发光剂、酶等呈色物或放射性核素等作为示踪物标记抗体分子，在适宜的条件下（即适宜的温度和pH等），标记抗体与抗原发生特异性的反应。3132常用标记物1. 荧光素（1）异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FIT

8、C）：绿色荧光；（2）四乙基罗达明：橙红色荧光；（3）四甲基异硫氰酸罗达明：橙红色荧光；（4）藻红蛋白：红色荧光2. 酶（1）辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）；（2）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）3. 金属标记物：如胶体金，多用于免疫电镜。 4. 放射性核素：涉及污染，防护难，一般不用。33检 测酶等呈色物与一定的底物结合后，可以形成具有特殊颜色的化合物，即可知道呈色物标记的抗体与相应的抗原形成的复合物的存在情况。荧光物质可以在高压汞灯的激发下，发出特定颜色的荧光，可以在荧光显微镜下被观察到。胶体金颗粒可以在透射电子显微镜（t

9、ransmission electron microscope，TEM）下观察。放射性同位素可以使胶片感光，经放射自显影后就可以知道标记抗体与抗原反应的情况。34毛细血管内皮细胞呈vWF阳性 （荧光素标记）35 海马细胞微管蛋白 绿色(胞体、树突) 轴突终末蛋白 红色(突触)36培养的成纤维细胞（微管呈绿色，核呈蓝色）37胰岛B细胞呈胰岛素阳性（辣根过氧化物酶标记）38上皮细胞膜MAM-6蛋白电镜图示（胶体金标记）39（五）常用免疫组织化学染色方法1. 直接法2. 间接法3. PAP法4. APAAP法5. ABC法6. SABC法7. LSAB法8. SP法9. SAP法401. 直接法将荧

10、光素或酶直接标记在第一抗体上，以检测相应的抗原。优点：简单；时间短；特异性强。缺点：灵敏度低，耗费抗体多。直接法412. 间接法先用荧光素或酶标记第二抗体，一抗为特异性抗体， 二抗仅有种族特异性。特点： （1）较直接法灵敏。 （2）可标记一种抗体，检测多种抗原。间接法42先将过氧化物酶（HRP）免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗HRP抗体；然后再与HRP结合，形成PAP复合物。特点：（1）敏感性较高；（2）背景染色低（相对）；（3）所染标本可长期保存。3. 过氧化物酶-抗过氧化物酶法（Peroxidase anti-peroxidase method，PAP）43PAP的原理示意图444. 碱性

11、磷酸酶-抗碱性磷酸酶法（ alkaline phosphatase anti-alkaline phosphatase method，APAAP法）APAAP法检测淋巴细胞亚群45美籍华人Hsu于1981年首次报道。该法以卵白素作为桥，把生物素化的抗体（二抗）与生物素结合酶（如HRP标记的生物素）连接起来。5. 亲和素-生物素过氧化物酶复合物法（avidin biotin-peroxidase complex，ABC ）46生物素/维生素H：它经过羟基丁二酰亚胺活化为生物素-N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS），其酯键可与抗原（Ag）、抗体（Ab）、酶以及核酸的氨基、羧基或糖基共价结合，达到很高的

12、比活性（即一个大分子上可以连接多个生物素分子）。生物素（biotin）/维生素H（S）47亲和素（avidin）/卵白素/抗生物素蛋白：碱性糖蛋白，分子量68 kDa，由4个相同的亚基组成，每个亚基可以与一分子生物素结合。它对生物素的亲和力很强，比抗原抗体的结合力高1万倍以上。链霉亲和素（streptavidin，SA）/链霉卵白素：链霉菌培养过程中的分泌产物，是一种非糖基化的酸性蛋白。它是一个四聚体蛋白，提供4个生物素结合位点。SA特异性更高，而且可以耐受较高的盐浓度（如2 mol/L KCl）和较强的变性剂（如1% SDS）。亲和素和链霉亲和素（S）48ABC复合物的制备4950ABC法的

13、优点（1）灵敏度较PAP法提高2040倍。（2）一抗和二抗可高度稀释，使背景染色下降。516. SABC法（Streptavidin Biotin-peroxidase Complex）：将ABC复合物中的卵白素换成链霉亲和素。7. LSAB法（labelled Streptavidin-Biotin）：将链霉亲和素和生物素先连结起来。8. SP法（Streptavidin Peroxidase conjugataed method）：将链霉卵白素和辣根过氧化物酶直接偶联在一起。9. SAP法（streptavidin alkaline phosphatase conjugataed meth

14、od ） ：将链霉卵白素和碱性磷酸酶直接偶联在一起。52（六）免疫组化在临床病理诊断中的应用（S） 标记淋巴造血组织及其肿瘤的细胞来源和细胞分化程度协助肿瘤良恶性的诊断鉴别低分化癌和肉瘤鉴别转移癌的性质协助发现骨髓、淋巴结微小转移癌灶鉴别小细胞恶性肿瘤癌组织耐药基因的检测 为癌症患者治疗方案的拟定提供依据确定肿瘤组织的增殖活性评估癌症患者的预后 检测病原体53第二节 蛋白质的定量检测一、凯氏定氮法二、双缩脲法三、Folin-酚试剂法（Lowry法）四、紫外分光光度法五、考马斯亮蓝G-250染色法六、BCA法54一、凯氏定氮法1983年由丹麦化学家凯道尔建立，以后经过改良使其更符合蛋白质定量的要

15、求。理论基础：各种蛋白质的含氮量很接近，通常占其总重量的16左右。蛋白质样品用浓硫酸消化后，可以转变为硫酸铵，硫酸铵中的NH4+与NaOH反应又可转变为NH3，用硼酸液吸收后，可由标准盐酸滴定并定量。由于蛋白质是体内的主要含氮物，因此，通过测定生物样品的含氮量便可估算出样品中的总蛋白质含量。 蛋白质含量含氮量 6.25此方法的测定范围为0.21.0 mg氮。55二、双缩脲法原理：蛋白质含有两个以上的肽键，故有双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）反应。在碱性条件下，肽键的质子被解离，Cu2+和失去质子的多肽链的氮相结合产生稳定的紫色络合物，在540560 nm的光吸收值与蛋白质的含量在一定

16、范围内呈线性关系。双缩脲法的具体操作参见P144145“双缩脲法测定蛋白质浓度”。 56显色反应仅与肽键数呈正比关系，与蛋白质的种类、分子质量及氨基酸组成无明显关系。Cu2+与氨基酸（Arg除外）和二肽均不发生反应，仅和1-亚氨基缩脲、2-亚氨基缩脲、丙二酰胺等少数几种物质有呈色反应。基本上可以认为双缩脲反应是蛋白质特有的反应。571951年由Lowery建立，是目前应用较广泛、灵敏地测定蛋白质含量的方法之一。原理：蛋白质在碱性条件下与试剂甲（双缩脲试剂）中的Cu2+形成络合物。由于蛋白质含芳香族氨基酸残基（如Tyr和Trp），生成的络合物可还原试剂乙（Folin-酚试剂）中的磷钼酸和磷钨酸而

17、产生钼蓝和钨蓝复合物，该复合物显蓝色，其颜色深浅与蛋白质浓度在一定范围内呈线性关系，可用于定量分析。三、Folin-酚试剂法/Lowry法（P145146）58Folin-酚试剂法注意事项Folin-酚试剂只在酸性溶液中稳定，但本实验在pH10条件下发生，因而加入Folin-酚试剂后立即混匀，使Folin-酚试剂在被破坏之前就发生反应。59优点：此法较双缩脲法灵敏。缺点：较费时。（P54）标准曲线的直线不太好。（P54）此法干扰物质较多。例如琥珀酸缓冲液、Tris缓冲液；螯合剂（EDTA等）；糖类（葡萄糖、蔗糖等）；还原剂（酚、-巯基乙醇等）、去垢剂（Triton等）；尿素；硫酸铵；三氯乙酸等

18、。Folin-酚试剂法的优点和缺点60四、紫外分光光度法由于蛋白质中的Tyr、 Trp 和Phe残基含有共轭双键，蛋白质溶液在275280 nm处有一紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质的A280与其浓度呈正比，据此可进行蛋白质定量测定。61五、考马斯亮蓝G-250染色法/Bradford法1976年由Bradford建立。原理：考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中以游离态存在时呈棕红色，它与蛋白质通过疏水作用结合后，变为蓝色。色素对可见光谱的最大吸收值从465 nm转移到595 nm处。蛋白质与色素的结合反应很快速，约在2 min左右的时间内达到平衡，在室温1 h之内是稳定的。在0.011.0

19、 mg蛋白质/mL范围内，蛋白质含量与OD595值呈正比。考马斯亮蓝G-250染色法的具体操作参见P146147“Bradford检测法”。62六、BCA法原理：BCA（bicinchoninic acid）是对一价铜离子（Cu+）敏感、稳定和高特异性的试剂。在碱性溶液中，蛋白质将Cu2+还原成Cu+，后者与测定试剂中BCA形成一个在562 nm处具有最大光吸收的紫色复合物。复合物的光吸收强度与蛋白质浓度呈正比。BCA的结构63BCA法原理示意图64第三节 免疫印迹法分析特定蛋白质的相对含量一、免疫印迹/Western blot的概念二、免疫印迹法检测样品中特异蛋白质的基本流程三、 Weste

20、rn blot的常用缓冲液配置四、 Western blot的操作步骤五、注意的问题65Western blot/免疫印迹：蛋白样品经过电泳分离后，转移并固定于膜上，然后应用抗原抗体反应进行特异性检测的方法。免疫印迹法是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白的定性方法，也可以作为确定同一种蛋白质在不同细胞或同一种细胞在不同条件下的相对含量的半定量方法。Southern blotNorthern blot一、免疫印迹/Western blot的概念66二、免疫印迹法检测样品中特异蛋白质的基本流程样品的凝胶电泳蛋白印迹封闭反应与特异性抗体（一抗）孵育与酶耦联的二抗孵育显色或化学发光显影观察和记录结果

21、6768三、Western blot的常用缓冲液配置电转移缓冲液 48 mmol/L Tris 39 mmol/L 甘氨酸 0.01% SDS 20% 甲醇TBST 20 mmol/L Tris-HCl/pH 7.5 0.15 mol/L NaCl 0.05% Tween-20封闭液（TBST+5%脱脂奶粉或牛血清白蛋白）抗体稀释液（TBST+1%脱脂奶粉或牛血清白蛋白）69四、Western blot的操作步骤用纯化的免疫小鼠，制备特异性的抗血清。制备样品，用SDS电泳分离。用（半干式）电转移法将蛋白质转至PVDF或NC膜上。（1）将聚丙稀酰胺凝胶浸泡在电转移缓冲液中平衡20 min以上。（

22、2）裁剪与凝胶大小一致的PVDF膜或NC膜。 注意：PVDF膜要先用甲醇浸润10 s，蒸馏水漂洗10 min，然后在电转移缓冲液中平衡10 min以上。NC膜直接在电转移缓冲液中平衡10 min以上即可。（3）裁剪合适大小的滤纸，用电转移缓冲液浸润，按阳极、三层滤纸、PVDF膜或NC膜、凝胶、三层滤纸、阴极的顺序叠放电转移三明治。（4）按0.5 mA/cm2膜恒流电转移1 h。70将膜在封闭液中室温反应60 min。转移膜至特异性的抗血清（一抗工作液）中，室温反应45-60 min。用TBST漂洗。3次，每次10 min。转移膜至碱性磷酸酶（AP）偶联的羊抗鼠IgG（二抗工作液）中，室温反应4

23、5-60 min。用TBST漂洗。3次，每次10 min。显色反应。将膜浸泡在NBT/BCIP显色液中，避光静置，待出现清晰条带后，把膜转移至蒸馏水中中止反应。观测和记录结果。71VP39的Western blot分析72五、注意的问题（一）样品的凝胶电泳1. PAGE2. SDS3. Tris-Tricine胶电泳：用于分子量小于10 kDa的多肽及蛋白质的电泳，能够获得较好的分离效果。73（二）转膜1. 戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。2. 滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致。3. 转膜方向要正确：凝胶在阴极，膜在阳极。4. 排除滤纸、凝胶和膜之间的气泡。5. 电转

24、时间可根据蛋白质分子量的大小灵活选择。6. 电转结束后，凝胶可用考马斯亮兰染色以确定转移效率。74（三）显色或显影1. 显色辣根过氧化物酶：底物为DAB。碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT。2. 化学发光显影最常用的辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品）。曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定。75第四节 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbant assay，ELISA）一、ELIAS的原理二、ELIAS的类型三、ELISA的步骤四、ELISA的常规生色底物（S）五、结果判断六、注意事项76原理：酶联免疫吸附试验是一种固相免疫测定技术，先将已知

25、的Ab或Ag包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标Ag或Ab按不同步骤与固相载体表面吸附的Ab或Ag发生特异性反应。最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其光密度（OD）值的大小进行定性或定量分析。优点：灵敏度高；特异性好；简便；重复性好。一、ELIAS的原理77酶标板780601酶标仪79二、ELIAS的类型（根据检测目的和操作步骤分类）1. 间接法2. 双抗体夹心法3. 竞争法801. 间接法间接法测抗体812. 双抗体夹心法/三明治法双抗体夹心法测抗原只适用于大分子抗原，不能用于测定半抗原等小分子物质823. 竞争法此法可用于抗原、半抗原和抗体的测定。原理：参考管中只加入酶标Ag，不加受检样品，因而与固相抗体结合的酶标Ag最多，颜色最深。测定管中加入酶标Ag和受检样品。受检样品的Ag量越多，竞争性抑制酶标Ag与固相Ab的结合，使得固相上结合的酶标Ag越少，测定管颜色就越浅。根据参考管与测定管OD值之比，计算样品中待测Ag的含量。竞争法测抗原83三、ELISA的步骤（以双抗体夹心法为例）向微孔板内加入抗特异性抗体进行包被。4C反应24-36 h或37C反应2