DB2301∕T 93-2021 高效大豆根瘤菌菌株筛选技术规程

1、 ICS 65.020.20DB2301CCS B 05黑龙江省哈尔滨市地方标准DB2301/T 932021高效大豆根瘤菌菌株筛选技术规程2021- 11-19发布2021-12-19实施 前 言本文件依据GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。I 高效大豆根瘤菌菌株筛选技术规程1范围本文件规定了高效大豆根瘤菌菌株筛选技术规程的术语和定义、大豆根瘤菌获得、大豆盆栽根瘤菌复筛、高效大豆根瘤菌田间验证和档案管理。本文件适用于哈尔滨市田间高效大豆根瘤菌菌株筛选。2规范性引用文件列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的

2、引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 3095GB 15618GB 20287NY 410环境空气质量标准土壤环境质量农用微生物菌剂根瘤菌肥料农用地土壤污染风险管控标准（试行）NY/T 1536NY/T 1735SN/T 2632微生物肥料田间试验技术规程及肥效评价指南根瘤菌生产菌株质量评价技术规范微生物菌种常规保藏技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1高效大豆根瘤菌存活能力强、具有高效固氮能力、竞争结瘤能力，接种后使大豆显著增产的大豆根瘤菌菌株。4大豆根瘤菌获得4.1大豆品种选择选择当地主导大豆品种。4

3、.2大豆根瘤采集在大豆盛花期时，选取叶色浓绿、生长旺盛的大豆植株，将大豆根系挖出带回实验室，用清水冲干净后，选取 4至 6个新鲜的颗粒饱满、深红色的大根瘤（带部分根）从根部分离。4.3大豆根瘤菌菌株分离与纯化1 将采集的根瘤用0.1%升汞溶液表面灭菌3min，无菌水冲洗8次10次。在无菌条件下，用镊子将根瘤压碎，挤出汁液涂布在根瘤菌琼脂培养基上，2628暗培养，快生菌培养3d4d，慢生菌培养5d 7d，将长出的单菌落采用划线培养法分离。根瘤菌琼脂培养基配方应符合NY 410中的规定。4.4大豆根瘤菌菌株确定肉眼观察菌落一致、无杂菌后再纯化1次2次，即获得纯菌株。根据获得菌株的菌体和菌落特征，可

4、初步确定为大豆根瘤菌，菌体和菌落特征应符合NY 410中的规定。将纯菌株在无菌条件下接种于根瘤菌液体培养基中，在180 rmin-1和28 的恒温摇床中培养至对数生长期，并将供试菌株的菌液在600 nm的OD值均调至0.8时作为接种菌液。大豆接种验证：选择当地主导大豆品种。大豆种子表面消毒后催芽，种芽长 1mm2mm时用纯菌株接种液浸泡1min2min，然后移植到试管根瘤菌琼脂斜面上。设不接种的阴性对照和接种已知菌的阳性对照，每个处理重复3次，在2025下培养，光强7000lx8000lx，每天光照时间12h13h。10d20d后观察大豆结瘤情况。如不接种的阴性对照结瘤，试验需要重做。空白对照

5、不结瘤，可以判定试验没有污染，在10稀释度中70%植株结有效瘤，用刀片将根瘤切开，若根瘤内部为粉红色、红色或-5褐色为有效根瘤，白色或绿色为无效根瘤，即确定接种菌为大豆根瘤菌菌株。4.5大豆根瘤菌菌株保存大豆根瘤菌菌株保存，应该符合SN/T 2632中的规定。5大豆盆栽根瘤菌复筛5.1试验准备蛭石采用间歇性高压湿热灭菌2次，每次1211h，然后置于阴凉通风处2d 3d。盆钵用5%次氯酸钠或0.1%高锰酸钾溶液消毒，并用无菌水冲洗，将灭菌蛭石装入盆钵中，浇适量无菌水备用。选择当地主导大豆品种。将4.2中确定的大豆根瘤菌菌株，制备成菌体数量1.010 cfu/mL的接种液，-9接种液制备应执行NY

6、/T 1735的规定。5.2盆栽实施和管理选择当地主导大豆品种。设置空白接种：将已表面灭菌的大豆种子播于灭菌后蛭石中。大豆接种验证（待测根瘤菌接种）：将已表面灭菌的大豆种子在待测根瘤菌接种液中浸泡1min 2min，移植到灭菌后的蛭石中。然后在2025下培养，光强7000lx 8000lx，每天光照时间12h13h。每盆定植1株2株大豆，不施肥或只施无氮营养液。5.3大豆根瘤菌与大豆品种的共生匹配性和固氮能力检测在大豆初花期，将植株连根取出后用清水洗净，观察根系结瘤情况和根瘤菌的有效性。不接种处理应不结瘤，若结瘤须重新进行盆栽实验。植株样品在105下杀青5min10min，再在80下烘至恒重，

7、测定每盆植株干重和含氮量，并计算植株总含氮量和待测接种菌株处理较不接种处理植株总氮量的增加量。植株含氮量测定及其增加量的计算应执行NY/T1735中的规定。接种待测菌株处理与不接种处理相比，收获大豆植株总氮量增加20%，统计检验达到显著水平，确定该待测菌为高效大豆根瘤菌。6高效大豆根瘤菌田间验证2 6.1试验设计试验处理：不接种根瘤菌、接种参比菌株、接种待测根瘤菌菌株。小区面积30m，每个处理32个重复，小区采用长方形，种植在2个不同土壤肥力地区，随机排列，试验设计应符合NY/T 1536的规定。6.2试验准备6.2.1试验地准备试验地选择应具有代表性，地势平坦，土壤肥力均匀，前茬作物一致，浇

8、排水条件良好，土壤肥力应为中低水平。试验田应避开道路、堆肥场所、水沟、水塘、高大建筑物及树木遮阴等特殊地块，应符合NY/T1536的规定。土壤环境质量应符合GB15618规定，空气环境质量应符合GB3095的规定。整地、设置保护行、试验地区划（小区、重复间尽量保持一致）；小区单灌单排；测定土壤的有机质、全氮、速效磷、速效钾、pH等基本理化性质。6.2.2根瘤菌菌株接种液准备按照试验设计准备所需要的根瘤菌接种液，菌液质量应符合GB 20287中的规定。6.2.3大豆品种准备选择当地主导大豆品种。田间试验实施和管理6.36.3.1施肥措施按照常规施磷肥和钾肥。根据土壤的含氮量可适当施用少量氮肥。6.3.2田间管理符合NY/T 1536的规定。6.4测产及评价大豆收获期，每个小区单打、单收、单计产或取代表样方测产。计算接种待测根瘤菌菌株处理与不接种处理产量相比，籽粒产量增加10%，统计检验达到显著水平；接种待测根瘤菌菌株处理与接种参比菌株处理相比，籽粒产量