分子诊断学重点内容(共8页)

1、分子诊断学重点(zhngdin)内容（Navy）1、分子诊断学（molecular diagnostics）是利用分子生物学技术来研究机体外源性和内源性生物大分子和大分子体系的存在、结构(jigu)或表达调控的改变，从而为疾病的预测、预防、诊治和转归提供分子水平信息。 2、基因：是一段携带功能产物（多肽，蛋白质，tRNA和rRNA和某些小分子(fnz)RNA）信息的DNA片段，是控制某种性状的的遗传单位。 3、密码子偏爱（codon bias ）指在不同物种的基因中经常为某种氨基酸编码的只是其中的一个密码子。当鉴别到一个ORF时，密码子偏爱常常用来确定这个ORF是否是一个基因。 4、基因组（g

2、enome）：指一个细胞或生物体的一套完整的单倍体遗传物质。 5、C值矛盾：生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象称为C值矛盾也称C值佯谬（ C value paradox） 6、N值矛盾：基因组中基因数目与生物进化程度或复杂程度的不对称性，称为N值矛盾或N值佯谬（N value paradox）。 7、基因组计划是指以获得某物种基因组全序列为主要目标的科学计划。 8、厘摩尔根（cM）即重组频率为1%的两个基因间的遗传距离 9、基因组学（Genomics）指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱）核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学。 10、鉴别蛋白

3、质编码基因的五项标准是什么？ 开放阅读框、密码子偏爱、序列保守性、转录产物、基因失活 11、原核生物是细菌等原始生物的总称，是最简单的细胞生物体 12、质粒：独立于细菌细胞染色体以外，能自主复制并稳定遗传的共价闭合环状DNA（cccDNA）分子，称为质粒(plasmid) 13、琼脂糖凝胶电泳泳动速度： 超螺旋DNA分子线性DNA分子半开环DNA分子14、接合作用(conjugation)当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作(conjugation)。 15、转化作用 (transformation)通过自动获取或人为

4、地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)。 16、转导: 以噬菌体为媒介把细菌的基因从一个细菌细胞转移到另一个细菌细胞的过程.一般是针对温和噬菌体, 溶血性噬菌体则不会发生转导. 17、转染: 病毒侵入宿主细胞过程. 对原核生物说, 转染是噬菌体侵入细菌细胞的过程 18、转座： 由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。 19、转座因子 可移动的基因成分，即能在一个(y )DNA分子内部或两个DNA分子之间移动的DNA片段，称为转座因子(transposable element ) 在细菌中，指

5、可在质粒和染色体之间或质粒和质粒之间可移动的DNA片段 20、转座因子(ynz)的分类：插入序列、转座子、可转座的噬菌体 21、基因转移(zhuny)的方式： 接合、转化、转导、转染 22、真核生物基因组的一般特征 （一）基因组庞大 （二）线状双链DNA和二倍体 （三）非编码区远多于编码区 （四）断裂基因（split gene） （五）大量重复序列存在 23、卫星DNA：由于这类序列的碱基组成不同于其他部份，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA 分开，因而称为卫星DNA （或随体DNA） 24、中度重复序列片段较长（100-几千bp)具有种属特异性，可作为DNA标记 25、基因家族(gene

6、family)一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因，在进化过程中从一个祖先基因经重复和突变演变而来的。 26、假基因（pseudogene）与具正常功能的基因序列相似，但无转录功能或转录产物无功能的基因。 27、所有组蛋白基因都不含内含子，而且组蛋白基因序列都很相似，从而编码的组蛋白在结构上和功能上也极为相似 28、质粒与核DNA区别： 1.非孟德尔的母系遗传 2.高突变率 3.异质性和复制分离 4.阈值效应 5.半自主复制与协同作用 29、线粒体病：由于线粒体呼吸链功能不良所导致的临床表现多样化的一组疾病。 30、CpG岛：大约有一半的人类基因富含CpG的顺序，称为CpG岛 31、单核苷

7、酸的多态性( single nucleotide polymorphism, SNP) 主要用途： 疾病的连锁分析与基因的定位 指导用药和药物设计 用于进化和种群多样性的研究 32、短串联重复序列 ( short tandem repeat , STR) STR在人类基因组内平均15-20kb就有一个STR 点位，占基因组的10%，多存在于非编码区及内含子中。主要用途： 人类基因遗传图谱的制作。目的基因筛选和基因诊断。法医学个体识别和亲权鉴定。 33、病毒（virus）是一类比较原始的、有生命特征的、能够自我复制的、严格细胞内寄生的非细胞生物，是结构最简单、最微小的生命形式。 34、末端正向重

8、复序列 又称末端冗余（terminal redundancy）是指双链DNA分子两端有一段相同的核苷酸序列 35、末端反向重复序列（inverted terminal repeat，ITR）指病毒基因组两端的反向互补重复序列。ITR可能与病毒的复制、转录及整合有关 36、重叠基因：许多病毒基因组的一段DNA序列有两个或两个以上的开放读码框架，可以编码两种或两种以上的多肽链，称为重叠基因 37、分段基因组：指病毒基因组由数条不同的核酸分子组成，多见于RNA病毒 38、乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）是目前已知感染人类(rnli)的最小的双链DNA病毒 39、RNA病毒基因组

9、为线状单链或双链，正链RNA病毒基因组均为线状RNA分子(fnz) 仅HDV的负链RNA病毒基因组为环状，其余的负链RNA病毒均为线状 40、正链RNA病毒：基因组序列与mRNA相同，可直接(zhji)作蛋白质合成的模板，此类RNA病毒具有侵染能力 41、负链RNA（-RNA）病毒：基因组序列与mRNA互补，基因组只有在其核衣壳蛋白转录酶存在下，才具有侵染能力 42、蛋白质组是指特定细胞、组织乃至机体作为一个生命单元中所拥有蛋白质的集合,即生命体中携带的基因信息在某一时段所表达的全部蛋白质。 43、蛋白质组学是指对在特定的时间和环境下所表达的群体蛋白质研究的一门学问。主要在蛋白质水平上探索蛋白

10、质的表达模式、作用模式、功能机制、调节控制以及蛋白质群体内的相互作用。是在生物体或其细胞的整体蛋白质水平上进行的,并从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动来揭示生命的规律。44、二维凝胶电泳是目前蛋白质组研究中最有效的分离技术。它由两向电泳组成,第一向以蛋白质电荷差异为基础进行分离的等电聚焦凝胶电泳,第二向是以蛋白质分子量差异为基础的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 45、质谱技术是样品分子离子化后,根据不同离子间的质量、电荷比值(质荷比,m/z)差异来确定分子量的技术。 46、凝胶滞后实验是近年来发展起来的用聚丙烯酰胺凝胶电泳直接分析核酸与蛋白质结合的简单、快速、敏感方法。通过蛋白质与末端标记的核

11、酸探针特异性结合,电泳时这种复合物较无蛋白结合的探针在凝胶中的泳动速度要慢,即表现为相对滞后。 47、细胞的破碎方法 机械法：液体剪切法与固体剪切法 本法不适合于染色体DNA的分离与纯化 非机械法：干燥法与溶胞法 溶胞法温和，能保证较高的得率与较好地保持核酸的完整性而得到广泛的应用 48、核酸的分离与纯化应去除的污染物主要包括 非核酸的大分子污染物 非需要的核酸分子 在核酸的分离纯化过程中加入的对后继实验与应用有影响的溶液与试剂 49、核酸浓缩最常用的方法-沉淀。其优点很容易地调整核酸溶液至所需浓度，能去除部分杂质与某些盐离子。 50、核酸沉淀的洗涤：用70%75%的乙醇51、核酸浓度测定 紫

12、外分光光度法：适用于0.25g/ml的核酸溶液 52、荧光光度法: 用溴化乙锭（EB）。灵敏度可达1ng5ng，适合低浓度核酸溶液的定量分析。SYBR Gold作为一种新的超灵敏荧光染料，可检出20pg的双链DNA 53、核酸纯度鉴定 (1) 紫外分光光度法：A260/A280 纯DNA比值为1.8，纯RNA比值为2.0。比值升高与降低均表示不纯。 比值为1.8的DNA溶液不一定为纯的DNA溶液 一般28S RNA的荧光强度约为18S RNA的2倍，否则提示有RNA的降解。 如果在加样槽附近有着色条带，则说明有DNA的污染。 54、核酸(h sun)的保存 DNA的保存 DNA溶于TE缓冲液中

13、在-70可以储存数年。 RNA的保存(bocn) RNA可溶于0.3mol/L NaAc溶液或双蒸水中，在-70至-80保存。以焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解(rngji)RNA可延长保存时间。RNA沉淀溶于70%乙醇或去离子甲酰胺液中，可在-20中长期保存。 55、基因组DNA分离与纯化的方法 酚抽提法、甲酰胺解聚法 、玻棒缠绕法、其他DNA快速提取法 56、裂解缓冲液中各成分的作用： EDTA：二价金属离子螯合剂，可抑制DNA酶活性，并降低细胞膜的稳定性。 SDS：阴离子去污剂，可降解细胞膜、乳化脂质和蛋白质，并使它们沉淀，同时降解DNA酶。 无DNA酶的RNA酶：可有效水解RNA而避免D

14、NA的消化 蛋白酶K：水解蛋白质，可消化DNA酶和细胞中的蛋白质。 酚：可使蛋白变性沉淀、抑制DNA酶活性。 pH8.0的Tris溶液：能保证抽提后DNA进入水相，而避免滞留于蛋白质层57、甲酰胺是一种离子化溶剂, 其作用： 裂解蛋白质与DNA的复合物、使释放的蛋白质变性、对蛋白酶K的活性无显著影响 58、玻璃缠绕法得到的DNA用途：构建基因组DNA文库、Southern印迹、PCR扩增 59、从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 DEAE纤维素膜插片电泳法 操作简单、对小于5kb片段回收率好、回收DNA纯度高、但不能回收单链DNA、不适于大于15kb的DNA片段回收。 电泳洗脱法 液氮冷冻挤压法 低

15、熔点琼脂糖凝胶块回收法 商品试剂盒(柱层析） 60、从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段标准方法：压碎与浸泡法 本法能很好地回收1kb的单链或双链DNA 61、碱裂解法提取质粒DNA基本原理： pH12.6高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA都变性，但质粒DNA超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来构型，保存在溶液中。 染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 62、质粒纯化：CsCl-EB等密度梯度超速离心法(标准

16、方法) 63、聚乙二醇(PEG)沉淀法 优点:简单、经济、适用广泛，尤其对碱裂解法提取质粒的纯化效果好. 适用: 分子克隆中所有常规的酶学反应、高效的哺乳动物细胞的转染。 缺点: 不能有效分离带切口的环状质粒DNA与闭环质粒DNA。 64、总RNA的分离与纯化：(异)硫氰酸胍-酚氯仿法 总RNA提取法中最常使用的是一步法。(异)硫氰酸胍-酚氯仿法是经典的一步法 65、同时制备RNA、DNA与蛋白质的一步法：是(异)硫氰酸胍-酚氯仿一步法的改进方法。(异)硫氰酸胍-酚的单相裂解试剂裂解细胞，再加入氯仿后形成两相。变性的DNA与蛋白质位于两相的界面。上层水相-RNA：通过异丙醇沉淀与75%乙醇洗涤

17、而获得。可用于mRNA的纯化、Northern杂交、逆转录和RT-PCR反应等。处于界面的DNA与蛋白质可通过乙醇和异丙醇分级沉淀出来。制备的DNA: 作PCR反应模板，蛋白质样品: 主要用于免疫印迹。 66、DNA重组（DNA recombination）不同来源的DNA分子，通过磷酸二酯键连接而重新组合的过程 67、重组DNA：在体外用限制性内切酶，将不同来源的DNA分子进行特异地切割，获得的目的基因或DNA片段与载体(zit)重新连接，从而组成一个新的DNA分子。 68、克隆（clone）由一个细胞经过无性繁殖以后(yhu)形成的子代群体。 69、DNA分子克隆：构建DNA重组体并导入宿

18、主细胞(xbo)建立无性繁殖体系 70、基因克隆： 重组的DNA分子能够通过一定的方式进入相应的宿主细胞，在宿主细胞中进行无性增殖，获得大量的目的基因或DNA片段的过程。 71、限制性内切酶：一类核酸水解酶，能识别和切割双链DNA分子中的特定核苷酸序列, 识别序列一般具双重对称性(回文结构) . 72、限制性内切酶的主要用途：改造和组建质粒组建基因组DNA物理图谱 基因组DNA同源性研究 DNA重组克隆及亚克隆 DNA杂交与序列分析 73、DNA连接酶(DNA ligase) 基因工程的缝纫针 催化双链DNA一端的3-OH与另一双链DNA5端的磷酸根形成3，5磷酸二酯键，使具有相同粘末端或平端

19、的DNA末端连接起来。T4噬菌体DNA连接酶-常用大肠杆菌DNA连接酶-少用 74、碱性磷酸酶：催化DNA，RNA以及核糖和脱氧核糖三磷酸上的 5 磷酸基团水解。 75、载体(Vector)携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。 76、载体具备的条件 宿主细胞中有自主复制能力或能整合到宿主染色体上与基因组一同复制的能力； 有合适的限制性酶切位点供外源DNA片段插入 分子量不宜过大，便于容纳较大的外源DNA片段并获得较高的拷贝数，也利于体外重组操作； 具有合适的筛选标记，如抗药性、酶基因、营养缺陷型或形成噬菌斑的能力等；配备与宿主相适应的调控元件，如启动子、增强子和前导序列等。

20、77、用作克隆载体的理想质粒一般具备的特点： 具有松驰型复制子；复制子外存在多克隆位点； 具有插入失活的筛选标记，如Ampr和Tetr；分子量相对较小但有较高的拷贝数。 78、噬菌体（Bacteriophage，phage）是一类细菌病毒的总称，即感染细菌的病毒。噬菌体严格依赖于细菌宿主细胞生长与繁殖，一旦脱离宿主细胞，尽管可以生存但不能生长与复制。 79、噬菌粒（phagemid）是一类由质粒与单链噬菌体结合而成的载体。常用的噬菌粒有pUC118 /pUC119和pTZ19U 80、黏粒（cosmid）又称柯斯质粒，是一种(y zhn)以噬菌体为基础，专门为克隆大片段而设计、并和质粒共同构建

21、的杂合载体。黏粒载体具有质粒和噬菌体载体的双重(shungchng)特性；具有高容量的克隆能力（3145kb）；具有与同源序列质粒进行重组的能力。黏粒主要同于真核细胞基因组文库的构建。 81、构建(u jin)基因组文库多用噬菌体和黏性质粒作为载体；构建cDNA文库和克隆较小DNA片段常用pUC系列质粒；M13噬菌体则用于克隆一些待测的DNA序列。 82、转化作用 (transformation)将重组的DNA分子引入细菌(原核细胞),使其在细菌体内扩增及表达的过程 83、转染作用 (transfection)将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的DNA重组体导入真核细胞的过程 84、在生长过程中

22、只有某一阶段的细菌才能成为转化的接受体，这称为感受态(competent)细菌。细菌的感受态可诱导产生，如氯化钙法就可诱导细菌成为感受态。感受态细菌表面其正电荷增加，细胞壁和膜通透性增加，有利于DNA分子吸附与吸收. 85、PCR技术的基本原理：在合适的缓冲体系中,通过加热使模板DNA双链中的氢键断裂形成单链，这个过程称为变性。在合适的温度条件下，特异性引物与模板DNA根据碱基互补的原则形成双链，这个过程称为退火。在DNA聚合酶的作用下，引物延伸，形成新的DNA链。如此循环往复，经过多个循环后，模板DNA在2个特异性引物之间的序列就会大量扩增。 86、 PCR技术的特点：高度的灵敏性、特异性、

23、操作简便易行、用途广泛87、PCR反应体系的影响因素:DNA模板、引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、缓冲液、热循环参数 88、PCR 扩增产物的检测和分析： Gel electrophoresis、Restriction endonuclease、Single strand conformation polymorphism （SSCP）、Nucleic acid sequence、Molecular hybridization 89、荧光定量 PCR：通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对 PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初

24、始模板量 90、基线：是扩张曲线的水平部分 91、CT值：从基线到指数增长期的拐点所对应的循环次数 92、绝对定量：用于确定未知样品中某个核酸序列的绝对量值，即通常说的拷贝数。 93、相对定量：用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序列表达的相对变化 94、荧光定量实时 PCR与普通 PCR的比较 实时在线监控：对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增加,直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性：使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了 PCR反应的特异性 增加定量的精确性：全程监控,准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便,无需跑胶 95、PCR-ASO

25、检测基因点突变 :是利用 PCR技术扩增靶基因的适当片段 ,然后(rnhu)用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针杂交 96、临床基因扩增检验实验室卫生部批准项目(xingm)：二级医院以上HBV、HCV、TB、CT、HIV、HLA 97、标准临床基因扩增检验实验室必须(bx)包括四个工作区域(working zones)： 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应区 产物分析区 四区须互相独立，并严格按照上述顺序设置，并遵循单一走向的工作区域。98、环境污染处理(Contamination around circumstances)： 稀酸或消毒液处理法、紫外线照射法 99、反应液污染的处理

26、：在PCR反应液（不含Taq DNA聚合酶和模板）中加入0.5uDNase I或核酸内切酶（如10u的Msp I），室温下30-60分钟。加热灭活DNase I或核酸内切酶，再加入Taq DNA聚合酶和模板做PCR 100、变性（denaturation）在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。 101、变性核酸的特点：粘度下降、沉降速度增加、浮力上升、紫外吸收增加 102、融解温度（Tm）在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度 103、影响Tm的因素：DNA碱基的组成、溶液的离子强度、pH值、变性剂 104、复性：变性DNA经过一定处

27、理重新形成双螺旋的过程。 105、影响复性速度的因素： DNA浓度、DNA片段的大小、 DNA片段复杂性、 合适的复性温度、适当的离子强度 106、杂交：两条来源不同，但具有互补序列的核酸，按碱基配对原则复性形成一个杂交体，这个过程即杂交，或称分子杂交。 107、探针（probe）指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。 108、基因探针：指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记（同位素或非同位素标记）的核苷酸链。 109、各类探针特点： 基因组DNA探针：无性繁殖、制备方法简单；不易降解（与RNA比较）；标记方法成熟。 cDNA探针（complementary DNA）：不含内含子及高度重复序列但不易获得 RNA探针：杂交效率高，稳定性高，非特异性，杂交较少,未杂交探针可用RNase 降解，减少本底的干扰。易降解，标记方法复杂 寡核苷酸探针 ： 可根据需要合成相应序列；探针短,序列复杂性低,分子量小，因此杂交时间短; 长 度只有1050bp，该识别序列内1个碱基的变化可明显降低杂交Tm值。可大量合成，价格低，能够用酶学或化学方法进行非放射性标记110、理想的探针(tn zhn)标记物应