重组人胸腺肽α1在大肠杆菌中的表达纯化与鉴定

1、重组人胸腺肽1在大肠杆菌中的表达纯化与鉴定尹凤红1,2，肖清江2，周卫东2，陈清西1* (1.厦门大学 生命科学学院，福建 厦门361102； 2.厦门特宝生物工程股份有限公司，福建 厦门361022) 摘要：采用大肠杆菌作为宿主表达重组人胸腺肽1 (rhT1)融合蛋白，纯化获得rhT1并对其鉴别于300 L发酵罐进行中试发酵表达rhT1融合蛋白；经IPTG诱导，离心发酵液收集菌体，菌体经破碎、离心、亲和层析捕获，获得融合蛋白；每升发酵液可获得约170 mg硫氧环蛋白-胸腺肽1融合蛋白融合蛋白经肠激酶酶切后、经亲和层析、反相层析、体积排阻层析等纯化步骤，获得高纯度rhT1；通过本纯化工艺获得的

2、rhT1原液经SDS和HPLC-SEC的检测纯度均大于99%；采用玫瑰花结形成率测定rhT1活性与市售化学合成胸腺肽（日达仙）标准品一致；质谱分析分子质量为3066.59 u，分子质量大小与去乙酰化的rhT1理论分子质量(3066 u)一致；N端测序结果与理论值一致说明本工艺可实现工业化规模生产关键词：重组人胸腺肽1蛋白；表达；纯化中图分类号：Q 3561 文献标志码：A 文章编号： 收稿日期：2015-03-30基金项目：国家高技术研究发展（863）计划（2007AA021604）*通信作者： HYPERLINK mailto: 胸腺素1（Thymosin-alpha 1，T1）作为免疫调节

3、因子，可以启动T淋巴细胞的成熟，刺激分泌干扰素及各种淋巴细胞介素，以及增强自然杀伤（NK）细胞介导的细胞毒性对T1的临床研究主要集中在治疗乙型肝炎及丙型肝炎方面，能够显著增强机体免疫力，对肝炎病毒的复制繁殖具有显著的抑制作用 1-3；也有有关T1治疗肺癌等肿瘤及其他免疫缺陷疾病的报道4-51977年由Goldstein等首次在胸腺组织内发现人胸腺肽1是由28个氨基酸组成，N端乙酰化的酸性多肽，其相对分子质量为3108 u、等电点为4.2、分子中有6对重复氨基酸残基；氨基酸序列为：N-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile- Thr-Thr-Lys

4、-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-C6目前人胸腺肽1生产工艺主要有两种：一种是生化提取法，另一种是化学合成法生化提取材料来源受限，有效成分胸腺肽1含量低（小于1%），成本高；化学合成的胸腺肽1虽然已经临床应用，但价格昂贵，在合成过程中污染环境当前临床用药以合成法生产的胸腺五肽和T1为主，其销售金额占据国内该类药物93% 的市场份额7采用基因工程技术生产的rhT1通过查询CFDA暂未有获批产品有关基因工程技术表达纯化的rhT1暂时还停留在实验室水平，发酵规模从摇瓶至20 L不等8,9 本文采用基因工程技术，构建高效表

5、达rhT1的表达菌株，在中试规模下，发酵表达并分离纯化，获得高纯度、高活性的rhT1，为rhT1产业化大生产打下坚实的基础1 材料和方法1.1 材 料大肠杆菌TOP10/ pThioHis A-T1 基因工程菌株由本实验室构建并保存；酵母提取物和蛋白胨为Oxoid公司产品，丙烯酰胺为Promega公司产品；Chelating Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow、SOURCE 30RPC及G-25填料为GE公司产品；T1标准品（日达仙）购自SciClone；其它试剂均为国产分析纯实验使用主要仪器：30 L、300 L全自动发酵罐，BBraun Bi

6、otech公司；全温振荡器，哈尔滨东明医疗器械厂；离心机，BECKMAN公司；P2B005A01超滤膜，Millipore公司；Basic 100蛋白纯化仪，GE公司；MALDI-TOF MS，Bruker公司；N端蛋白序列分析仪，岛津公司； 1.2 方 法1.2.1 rhT1 融合蛋白的发酵表达取rhT1工程菌株TOP10/pThioHis A-T1，按1：400（体积比）接种于150 mL LB培养基/1000 mL三角瓶，37 、200250 rpm培养68 h为一级种；一级种子按1：200（体积比）接种至24 L LB培养基/30 L种子罐，37 、200250 rpm培养68 h为二

7、级种二级种按1：6（体积比）接种到含150 L LB培养基的D300发酵罐中，37 ，DO 30%60%培养，待菌液浓度达OD600nm=3.0，用含1 mmol/L IPTG的氮源补料液1.5 L于2 h内流加诱导，过程中补加碳源或2 mol/L NaOH以维持pH 7.0，诱导总时长约7 h1.2.2 菌体收集和破碎发酵完毕，离心收集菌体，菌体用pH 8.0的20 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl缓冲液重悬后采用35 MPa高压破碎2次；再用高速冷冻离心机以10，10000 rpm离心40 min，获得上清液1.2.3 rhT1融合蛋白的捕获初步纯化离心上清液，

8、上样Chelating Sepharose Fast Flow（CS）层析柱，采用pH 8.0的20 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液和pH 8.0的20 mmol/L NaCl，50 mmol/L 咪唑，50 mmol/L Tris-HCl缓冲液，以梯度洗脱方式洗脱目的蛋白，按峰收集目的样1.2.4 rhT1融合蛋白的酶解亲和层析捕获的rhT1融合蛋白，用5K超滤膜（0.1 m2）浓缩，超滤替换成pH 8.0的1 mmol/L CaCl2，50mmol/L Tris-HCl缓冲体系，收集样品，并调节浓度至1 mg/mL；按摩尔比为1:30（EK酶/底物）的

9、比例，加入EK酶并混匀，48酶切16 h1.2.5 rhT1的分离纯化取EK酶切后的样品，首先通过Chelating Sepharose Fast Flow（CS）层析柱初步纯化，上样预先用pH 8.0的20 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡的CS柱，收集样在214 nm检测进一步应用Q Sepharose Fast Flow（QFF）层析柱纯化，将CS穿透样上样至预先用pH 8.0的20 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡好的QFF层析柱，用pH 8.0的250 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-

10、HCl缓冲液洗脱目的多肽然后，将收集到的QFF柱后的目的多肽通过SOURCE 30RPC层析柱进行精细的纯化，用流动相0.07%三氟乙酸-2.0%乙腈(体积分数)和流动相0.07%三氟乙酸-80.0%乙腈(体积分数)梯度洗脱，按峰收集目的多肽继而用Q Sepharose Fast Flow层析柱纯化，采用pH 8.0的400 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱目的样品，收集获得rhT1最后，精细分离纯化后的样品以不高于20%的柱床体积上样Sephadex G-25 Medium分子筛，用pH7.0的10 mmol/L PBNa缓冲液洗脱，收集目的样；0.2

11、2m过滤膜过滤除菌，分装即为原液，-65以下冻存1.2.6 rhT1的纯度检测和理化性质鉴定采用脱E受体法测定T1活性，显微镜下计数不少于200个淋巴细胞的玫瑰花环，计算玫瑰花环形成率rhT1的纯度鉴定采用SDS及高效液相（HPLC-SEC）的方法分析检测SDS电泳的积层胶浓度为5%(质量分数)，间隙胶浓度10%(质量分数)，分离胶浓度16%(质量分数)；上样量20 g，电压80160V，考马斯亮蓝G250染色HPLC-SEC的方法样品释到0.2 mg/mL，取50 L上样(10 g)，按面积归一化法计算其纯度 1.2.7 重组人胸腺肽1的氨基酸序列分析及质谱分子量检定采用Edman降解法检测

12、rhT1的N末端15个氨基酸序列，检测分析委托中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院中心实验室进行，仪器为PE/ABI PROCISE 491测序仪，检测程序PL-PVDF-protein采用BRUKER公司REFLEXTMIII型基质辅助激光解吸电离/飞行时间（MALDI-TOF MS）质谱仪，MALDI-TOF MS法测定rhT1分子质量；基质为-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）2 结果与分析2.1 rhT融合蛋白的发酵表达不同诱导时间的发酵液进行取样，扫描后取相同OD600的菌体，高温破碎，15%SDS电泳检测，试验结果见图1-A，rhT1融合蛋白表观分子质量约为19 k

13、 u，随着诱导时间的延长，发酵的目的产物逐渐增加，诱导后4 h后表达稳定，随着时间的延长可以获得更多的生物量的积累利用软件SmartView2001分析计算得到细胞裂解蛋白中融合蛋白所占比例为40%300 L发酵罐最终可获得发酵液约190 L，离心可获得3.3 k g菌体ArhT1融合蛋白发酵菌体裂解样电泳图：lane1：LWM ； lane3：rhT1 诱导0 h对照；lane4：rhT1 诱导1 h后；lane611：rhT1诱导27 h样品 B菌体破碎及rhT1融合蛋白的CS捕获电泳图谱：lane1：LWM；lane3：CS层析柱清洗样；lane5：发酵菌体处理上清；lane6：发酵上清

14、；lane7：破碎后离心沉淀处理上清；lane8：破碎后上清；lane9：CS层析柱穿透样；lane10：CS层析柱目的样图1 发酵菌体裂解液、菌体破碎及CS捕获电泳图Fig.1. Analysis of T1 fermentation、crushing and capture by SDS2.2 菌体破碎菌体破碎后，进行SDS电泳检测，试验结果见图1-B lane7，在高压破碎的离心沉淀中无目标蛋白检出（菌体高压破碎的离心沉淀，重悬后进行煮沸裂解），lane8的破碎后上清中含有rhT1融合蛋白，证明细胞破碎完全，破碎条件合适2.3 rhT1融合蛋白的捕获初步纯化通过基因工程设计与构建，发酵表

15、达的rhT1融合蛋白N末端带有6个His氨基酸，可特异性与CS层析填料结合，基于这个原理，采用CS层析填料来捕获rhT1融合蛋白，并与其它蛋白或杂质分离含有rhT1融合蛋白的破碎上清通过CS层析柱后，rhT1融合蛋白特异性结合到层析柱上，而其它蛋白或杂质则穿透或被冲洗掉，然后通过洗脱液洗脱目的蛋白，获得高纯度的rhT1融合蛋白纯化洗脱图谱见图2-A，电泳检测图谱见图1-B，由图1-B判断，上样的穿透样(lane 9)及层析柱清洗样（lane3）均为杂质，目的洗脱样（lane10）为高纯度的rhT1融合蛋白试验结果显示，采CS层析柱，在该纯化条件下，捕获分离效果良好，可获得高纯度的rhT1融合蛋

16、白3.3 kg菌体破碎并经亲和层析捕获后可获得融合蛋白约33 g，折算每升发酵液可获得融合蛋白173 mg，目的蛋白表达水平基本满足工业化规模生产2.4 rhT1融合蛋白的酶切通过基因工程设计，表达的rhT1融合蛋白的N末端6个组氨基酸（His）通过肠激酶酶切识别氨基酸序列与rhT1连接，因此采用肠激酶酶切rhT1融合蛋白，以获得正确氨基酸序列的rhT1EK酶切的rhT1融合蛋白SDS检测图谱见图3-A，由图3-A lane1、lane3可见，48酶切16 h后，融合蛋白酶切效率达85%以上2.5 rhT1的纯化2.5.1 rhT1的初步分离纯化rhT1融合蛋白，经EK酶切后，目的蛋白rhT1

17、与组氨酸纯化标签断裂分开，因此采用CS层析柱结合组氨酸纯化标签，而穿透为rhT1，由于穿透样品浓度稀，体积大，不利于进行后续纯化处理，因此采用QFF层析柱浓缩CS穿透样品因胸腺肽一级结构中无含苯环氨基酸，280nm检测收集样品不灵敏，故采用214nm检测收集样品CS及QFF纯化洗脱图谱分别见图2-B和图2-C，电泳检测图谱见图3-A，由图3-A可见，CS层析的穿透样表观分子质量大于2.5ku，为rhT1，经QFF浓缩后，无明显杂质2.5.2 rhT1的精细分离纯化为了获得高纯度的rhT1，进一步采用反相分离技术，分离去除rhT1的相关蛋白或杂质后，再用QFF层析柱去除有机溶剂和浓缩目的样品纯化

18、洗脱图谱见图2-D、2-E，电泳检测图谱见图3-B，由图3-B可见，精细纯化后再浓缩可获得高纯度的rhT12.5.3 rhT1的原液制备QFF层析柱精细纯化后的rhT1用G-25 分子筛脱盐替换为pH7.0，10 mmol/L PBNa缓冲液，收集目的样；其洗脱见图谱2-F，由图2-F可见，目的样品峰与离子峰分离效果良好，G-25层析柱收集到的样品用0.22 m过滤膜过滤除菌，分装即为原液，-65以下冻存 A. rhT1融合蛋白的CS捕获图谱；B. rhT1的CS层析初步纯化图谱；C. rhT1的QFF阴离子层析浓缩图谱；D. rhT1的RPC反相层析精纯图谱；E. rhT1的QFF阴离子层析

19、浓缩图谱；F. rhT1的G-25分子筛脱盐图谱图2 rhT1的分离纯化层析图谱Fig.2. Purification of Thymosin1 by AKTA Basic 100A.融合蛋白酶切及CS柱捕获小肽胶电泳图谱；lane1：超滤浓缩样（融合蛋白）；lane2：小肽Maker；lane3：EK酶切样；lane46：CS柱穿透样； lane7：洗脱杂质；Lane 8：QFF浓缩样品. B. rhT1的精细分离纯化电泳图谱；lane1：小肽Maker；lane26：RPC反相层析peak 15；lane7：QFF浓缩样.图3 T1纯化样品电泳检测图谱Fig.3. Analysis of

20、Thymosin1 by SDS2.6 rhT1原液活性、纯度检测及理化性质鉴定2.6.1 rhT1原液活性检定胸腺肽可使脱E受体后的胸腺T细胞恢复其E受体功能，从而反映胸腺肽的生物活性本检测参考胸腺肽溶液质量标准脱E受体法测定玫瑰花结增加率反应T1活性结果见表1，自制rhT1的玫瑰花结增加率为50.0%，市售化学合成的胸腺肽1（日达仙）的玫瑰花结增加率为53.3%，相比较空白均有明显提高；另外本次检测自制样品活性为日达仙的96%，基本一致表1. rhT1活性计算Tab.1. calculation activety of rhT1编号样品花环形成率/%活性增加量/%花环增加率/%T/C值/%

21、B空白21.2TrhT1(自制)31.810.650.095.5C日达仙(市售)32.311.153.3注：活性增加率增加量/空白.2.6.2 rhT1纯度检定1）采用SDS电泳检测rhT1的纯度以日达仙作为参照品，分别上样控制带5%，2%，1%，电泳结果（见图4）表明：供试品中无可见杂蛋白，样品的电泳纯度大于99%lane1：LWM； lane2：空； lane3：rhT1供试品 20 g；lane4：空；lane5：日达仙 20 g；lane6：日达仙1 g；lane7：日达仙 400 ng；lane8：日达仙 200 ng.图4 rhT1供试品16%SDStricine电泳检测图谱Fig

22、.4. Analysis of Purity rhT1 product Detector by tricine SDS2）采用HPLC检测rhT1的纯度HPLC-SEC检测方法进行本样品的关键纯度检测重组人胸腺肽1 HPLC-SEC的检测结果见图5，结果表明检测样品中rhT1的峰面积占总面积的99.84%，表明有关物质远小于5%的注册标准10（制剂）图5. rhT1原液 HPLC-SEC 检测图Fig.5. Analysis of Purity of rhT1 by HPLC-SEC2.6.3 重组人胸腺肽1鉴别检测1）rhT1的N端氨基酸序列测定N端序列测定是蛋白质及多肽一级结构确认的重要组

23、成部分，也是重组蛋白药物质量控制的必检项目经N端氨基酸序列测定，rhT1样品N-末端15个氨基酸残基序列为N-SDAAV DTSSE ITTKD-C检测结果与已知rhT1的N-末端氨基酸残基序列一致2）rhT1质谱法测定分子量检测结果：供试品rhT1质谱检测分子质量为3066.59 u（见图6），分子质量大小与去乙酰化的T1理论分子质量(3066 u)一致图6 MALDI-TOF MS法测定rhT1分子质量Fig.6. Mass spectrum of rhT1 by MALDI-TOF MS3讨 论目前常用的制备低分子量多肽的基因工程重组技术有两种，一种是通过串联多个目标基因来获得高表达，虽

24、然该方法已有较多成功例子，但是本实验室尝试使用四段或两段多肽的串联表达，结果均未见目的蛋白表达，因此本实验室放弃该方法；另一种方法是通过融合表达，其优点是融合蛋白可携带纯化标签，可通过亲和层析高效获得高纯度目的蛋白，大大简化了下游纯化工作，因此本实验室采用第二种方法制备重组人胸腺肽1本方法主要分为3个纯化部分：1）采用CS亲和层析作为捕获步骤，捕获带有纯化标签的目标蛋白，快速的与细胞破碎后释放的酶、核酸、菌体蛋白、内毒素以及色素分离，有利于融合蛋白的稳定；2）EK酶切后蛋白首先用CS亲和层析纯化，存在于酶解混合物中的硫氧还蛋白以及少量未被酶解的融合蛋白由于分子中仍存在His-tag序列，因而被

25、吸附于CS柱上，而酶解释放出来的游离rhT1则出现在穿透峰中；3）将穿透目标样品用QFF柱浓缩后，再经SOURCE 30RPC反相层析进行精纯，再次浓缩后替换缓冲体系，即为rhT1纯品样品活性、纯度分析及鉴别，采用脱E受体法测定T1活性，以日达仙作为参考品，其活性相当；用质谱检测rhT1分子质量为3066.59 u，与去乙酰化的rhT1理论分子质量3066 u相符；rhT1样品N-末端15个氨基酸残基序列为SDAAVDTSSE ITTKD，检测结果与已知胸腺肽1的N-末端15个氨基酸残基序列为一致； SDS结果表明，rhT1纯度超过99%；HPLC-SEC纯度为99.84%，远大于5%的注册标

26、准本检测中使用的参考品为市售胸腺肽1，商品名为日达仙，其为化学合成，分子质量与天然的胸腺肽1一致为3108u相关报道称采用基因工程重组技术得到N端未乙酰化的胸腺肽1，其全部化学性质和体外生物活性与化学合成的胸腺肽1及天然的胸腺肽1相一致11，本实验室结论与其一致用该方法生产胸腺肽1比用化学合成生产的胸腺肽1成本大为降低，与生化提取方法相比，又具有操作简单，易于放大、工艺取材不受限制以及活性高等优点，本实验获得高纯度的重组人胸腺肽，为重组T1的工业化生产提供可靠的技术支持参考文献：1 Sugahara S. Ichida T. Yamagiwa S. et al. Thymosin-alpha1

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