《生物化学》课件第2章 核酸1

1、第二章 核酸Nucleic Acids第一节 概 述核酸(nucleic acid) 以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。 DNA（Deoxyribonucleic acid)脱氧核糖核酸 RNA（Ribonucleic acid) 核糖核酸1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素” 1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构1968年 Nirenberg发现遗传密码1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法1985

2、年 Mullis发明PCR 技术1990年 美国启动人类基因组计划(HGP) 1994年 中国人类基因组计划启动2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架一、核酸的发现和研究工作进展 二、核酸的分类及分布、功能(deoxyribonucleic acid, DNA)(ribonucleic acid, RNA)脱氧核糖核酸 核糖核酸 90%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。分布于胞核、胞液。携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。三、元素组成主要元素组成： C、H、O、N、P(

3、911%)与蛋白质比较，核酸一般不含S，而P的含量较为稳定，占9-11%。 四、基本构成单位：核苷酸(nucleotide)核苷酸由戊糖、磷酸和含氮碱三部分构成第二节 核酸的分子组成戊 糖碱 基先将嘌呤和嘧啶的结构式记住，然后再记住下面口诀胸前一滩尿：U + 一碳基团（甲基） T尿里两泡泡：嘧啶中有两个O U上面一个是氨气包：U靠上面的一个O换成-NH2 =C鸟儿张嘴吸氨气：张嘴即O，嘌呤有O又有-NH2 G腺儿将鸟嘴来系，注意换气（氨气）：系嘴即去掉O，G去掉O再把-NH2换个位置 A 胺式亚胺式互变异构酮式烯醇式互变异构碱基的结构特征嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系，在紫外区有吸收（

4、260 nm左右）。核苷 nucleoside糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键。核糖核苷：AR, GR, UR, CR脱氧核苷：dAR, dGR, dTR, dCR核苷酸(ribonucleotide)的结构与命名核苷和磷酸以磷酸酯键连接稀有核苷酸修饰成分核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。 2、稀有核苷酸：稀有碱基/核苷/核苷酸 3、核苷酸的其他形式多磷酸核苷（NDP、NTP)环化核苷酸（cAMP、cGMP等）辅酶或辅基（NAD、NADP、FAD、CoA等，均含有AMP），活性代谢物（UDPG、CDP-胆碱，等） 1、核苷酸的组成：含氮

5、碱基、戊糖和磷酸。ATP的性质ATP 分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。ATP水解时, 可以释放出大量自由能。ATP 是生物体内最重要的能量转换中间体。ATP 水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。ATP 也是一种很好的磷酰化剂。磷酰化反应的底物可以是普通的有机分子，也可以是酶。磷酰化的底物分子具有较高的能量（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤。cAMP和cGMPcAMP(3,5-环化腺苷酸)和cGMP(3,5-环化鸟苷酸)的主要功能是作为细胞的第二信使。cAMP和cGMP的环状磷酯键是一个高能键。在pH7.4, cAMP和cGMP的水解能约为43.9 KJ/mol，

6、比ATP水解能高得多。腺苷酸也是一些辅酶的结构成分第三节 核酸的分子结构一、一级结构（primary structure）一级结构是指核酸分子中核苷酸的排列顺序及连接方式。核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。1、核苷酸的连接方式： 3, 5磷酸二酯键2、核酸的基本结构形式：多核苷酸链信息量：4n末端： 5 端、 3端多核苷酸链的方向： 5端3端(由左至右)3、表示方法：结构式、线条式、文字缩写 碱基组成分析Chargaff 规则：A = T；G C 碱基的理化数据分析：A-T、G-C以氢键配对较合理 DNA纤维的X-线衍射图谱分析 DNA双螺旋结构的研究背景 二、DNA的空间结构（一）DNA的二级

7、结构（secondary structure）1、碱基组成规则(Chargaff规则)A=T，G=C； A+G=T+C(嘌呤与嘧啶的总数相等)有种属特异性无组织、器官特异性不受年龄、营养、性别及其他环境等影响 DNA分子由两条DNA单链组成。DNA的双螺旋结构是分子中两条DNA单链之间基团相互识别和作用的结果。双螺旋结构是DNA二级结构的最基本形式。DNA双螺旋结构的特点double helix modelDNA双螺旋结构的要点（1）DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为5端3端，

8、而另一条链的方向为3端5端。（2）嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90角。（3）螺旋横截面的直径约为2nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈的高度）为3.4 nm。（4）维持两条DNA链相互结合的力是链间碱基对形成的氢键。碱基结合具有严格的配对规律:A与T结合，G与C结合，这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。（5）螺旋表面形成大沟(major groove)及小

9、沟(minor groove)，彼此相间排列。小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别DNA碱基序列的基础。（6）氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。（二）二级结构： 双螺旋结构模型(double helix model)1、Watson-Crick双螺旋结构模型(B-DNA) （1）反平行双链：脱氧核糖-磷酸骨架位于外侧，碱基对位于内侧 （2）碱基互补配对：AT配对（两个氢键），GC配对（三个氢键）；碱基对平面垂直纵轴（3）右手双螺旋：螺距为3.4 nm，直径为2.0 nm，10bp/圈（4）表面功能区：小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别DNA碱基序列的基础 （5）维持结构稳定的力量

10、：氢键维持双链横向稳定，碱基堆积力维持螺旋纵向稳定2、其他螺旋形式 Z-DNA（左手双螺旋） A-DNA DNA double helix类型 helix type bp/turn rotation/bp vertical rise/bp helical d A 11 +34.7 2.56A 23A B 10 +34.0 3.38A 19A C 9.33 +38.6 3.32A 19A Z 12 -30.0 5.71A 18ADNA双螺旋的稳定性DNA双螺旋结构在生理条件下很稳定。维持这种稳定性的因素包括：两条DNA链之间形成的氢键，碱基堆积力。双螺旋结构内部形成的疏水区，消除了介质中水分子对

11、碱基之间氢键的影响；介质中的阳离子（如Na+、K+和Mg2+）中和了磷酸基团的负电荷，降低了DNA链之间的排斥力等。改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。 天然存在的DNA分子最显著的特点是很长，分子质量很大，一般在1061010。大肠杆菌染色体由400万碱基对(basepair，bp)组成的双螺旋DNA单分子。其长度为1.4106nm，相当于1.4mm，而直径为20nm，相当原子的大小。黑腹果蝇最大染色体由6.2107bp组成，长2.1cm多瘤病毒的DNA由5100bp组成 ，长1.7mm（二）DNA的三级结构双螺旋进一步扭曲,形成一种比双螺旋更高层次的空间构象。包括：线状DNA形成

12、的纽结、超螺旋和多重螺旋、环状DNA形成的结、超螺旋和连环等大多数原核生物 ：1）共价封闭的环状双螺旋分子2）超螺旋结构：双螺旋基础上的螺旋化正超螺旋(positive supercoil):盘绕方向与双螺旋方同相同负超螺旋(negative supercoil):盘绕方向与双螺旋方向相反 （三）DNA在真核生物细胞核内的组装核小体(nucleosome)： 由DNA和组蛋白构成。DNA：以负超螺旋缠绕在组蛋白上组蛋白核心：H2B ,H2A ,H3 ,H4H1组蛋白在核小体之间（三）DNA的功能DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是

13、个体生命活动的信息基础。基因从结构上定义，是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。 三、RNA的分子结构Mitochondrial RNARNA的结构特点RNA是单链分子，因此在RNA分子中，嘌呤的总数不一定等于嘧啶的总数。RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成单链突环。这种结构称为“发夹型”结构。在RNA的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象DNA中严格。G 除了可以和C 配对外，也可以和U 配对。G-U 配对形成的氢键较弱。不同类型的RNA, 其二级结构有明显的差异。tRNA中除了常见的碱基外，还存在一些稀有碱基，这类碱基大部分位于突环

14、部分.（一）信使RNA的结构与功能* 真核生物mRNA的结构特点1. 大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。2. 大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。mRNA核内向胞质的转位mRNA的稳定性维系翻译起始的调控 帽子结构和多聚A尾的功能* mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。DNAmRNA蛋白转录翻译原核细胞 细胞质细胞核DNA内含子外显子转录转录后剪接转运mRNAhnRNA翻译蛋白真核

15、细胞 （二）tRNA的结构与功能* tRNA的一级结构特点 含 1020% 稀有碱基，如 DHU 3末端为 - CCA-OH 5末端大多数为G 具有 TC 双氢尿嘧啶(DHU)假尿嘧啶()次黄嘌呤(I)* tRNA的二级结构三叶草形 氨基酸臂 DHU环 反密码环 额外环 TC环氨基酸臂额外环* tRNA的功能：活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。1、分子较小，含较多的稀有碱基和非标准碱基配对2、5端一般为鸟嘌呤核苷酸，3端为CCA-OH3。3、二级结构为“三叶草”型（cloverleaf pattern）小结反密码环：反密码环中部的三个碱基可以与mRNA的三联体密码形成碱基互补配对，解

16、读遗传密码，称为反密码子（anticodon）。ACCDHU环T环反密码环5额外环氨基酸臂：3末端的CCA-OH3单链用于连接该tRNA转运的氨基酸。 二氢尿嘧啶环（DHU）：识别氨酰-tRNA合成酶TC环：识别核蛋白体（核糖体）4、“倒L”型三级结构（三）rRNA的结构与功能原核生物（以大肠杆菌为例）真核生物（以小鼠肝为例）小亚基30S40SrRNA16S1542个核苷酸18S1874个核苷酸蛋白质21种占总重量的40%33种占总重量的50%大亚基50S60SrRNA23S5S2940个核苷酸120个核苷酸28S5.85S5S4718个核苷酸160个核苷酸120个核苷酸蛋白质31种占总重量的

17、30%49种占总重量的35%核蛋白体的组成* rRNA的功能:组成核蛋白体，作为蛋白质合成的场所。（四）其他小分子RNA及RNA组学除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs),或非编码蛋白质的RNA(non-coding RNA, ncRNA) 。 种类：核内小RNA；核仁小RNA；胞质小RNA；催化性小RNA；小片段干涉 RNA功能：参与hnRNA和rRNA的加工和转运。ncRNA在在基因表达以及应激信号传导等方面起着重要的调节作用。因此，有人也将其称为调节RNA（reg

18、ulatory RNA）。 小片段干扰RNA （siRNA；又称“引导RNAs”，guide RNAs）：一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNA interference，RNAi，也译作RNA干预或干涉）。它是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。RNAi的作用机制：包括起始阶段和效应阶段。（1）在起始步骤，生物宿主将外源基因表达的双链RNA进行切割，产生具有特定长度（19-21nt）和序列的小片段RNA；（2）在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RIS

19、C）。激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3端12个碱基的位置切割mRNA。RNA组学研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。 RNA组学:第四节 核酸的理化性质 一、酸性化合物 两性解离，但酸性强 电泳行为泳向正极（pH7-8） 二、高分子性质 粘度 DNARNA 超离心沉降 凝胶过滤 分子大小单位：分子量（道尔顿，D）、碱基对数目（bp）、离心沉降常数（S） 沉淀行为加盐（中和电荷）；乙醇紫外吸

20、收1. DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50g/ml双链DNA40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0OD260的应用 三、紫外吸收 最大吸收波长：260nm 核酸定量分析 核酸定性分析 四、变性、复性、分子杂交1、DNA变性（DNA denaturation）：DNA变性是指在理化因素作用下，DNA分子中的氢键断裂，碱基堆积力遭到破坏，双螺旋结构解体，双链分开形成单链的过程。 DNA的变性(denaturation)方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如

21、尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：OD260增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变；生物活性改变DNA变性的本质是双链间氢键的断裂DNA变性增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。当DNA的稀盐溶液加热到80-100时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。 80 90 100 100%50%OD260（254） Tm 变性温度范围融解温度（melting temperature,Tm）：DNA热变性过程中，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称为融解温度（Tm）或解链温度、变性温度。 实验室常用的方法热变性影响Tm值

22、的因素(1)溶液的性质(2)DNA的性质和组成大肠杆菌DNA在不同浓度KCl溶液下的熔融温度曲线GC含量越高，Tm越大 （1）变性后理化性质改变DNA溶液的粘度降低浮力密度增加旋光偏振光改变紫外吸收增加（高色效应）高色效应（hyperochromic effect）：DNA变性后，在260nm处的紫外吸收增高，称为高色效应或增色效应。 （2）变性后的DNA一级结构没有改变。（3）融解温度（melting temperature,Tm）：DNA热变性过程中，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称为融解温度（Tm）GC含量越高，Tm越大DNA越长，Tm越大溶液离子强度增高，Tm值增加DNA越纯，相

23、变范围越小 2、DNA复性DNA复性(renaturation)的定义:在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。减色效应（hypochromic effect ）:DNA复性时，其溶液OD260降低。DNA复性在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。核酸分子杂交(hybridization) 核酸的杂交DNA-DNA杂交双链分子变性 复性 不同来源的DNA分子核酸分子杂交的应用:研究基因的位置确定两种核酸序列的相似性检测样品中的特异序列基因芯片技术的基础 核酸探针（nucleic acid probe）:能特异性的探测带某一特定序列的DNA或RNA分子的标记核酸分子。3、核酸分子杂交(h