《生物化学》本科课件第8章+酶通论

1、第8章 酶通论“Alice and the Queen of Hearts,” illustrated by John Tenniel, The Nursery Alice. (Mary Evans Picture Library, London)酶的发现及研究历史人们对酶的认识起源于生产与生活实践。夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。公元前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。酶者，酒母也酵素的发现 尼罗河流域盛产小麦，古埃及人将小麦磨成粉，加入水、马铃薯及盐拌在一起，摆在温热的地方，空气中的酵母落入一块未被烤过的面团中，面团竟慢慢地涨大起來，这种面团

2、烤出来后非常松软，从此人们便故意留一块面团，让酵母慢慢使它发大、变酸，再取一团作“面种”留待下次发面包。古埃及人只知道方法，却不懂得其原理，因此一直认为这是神在暗中帮忙，而认定面包是“神的赠礼” enzyme (in yeast)enzyme是希腊文 en = in ， zyme = yeast西方国家19世纪对酿酒发酵过程进行了大量研究。直到1897年，德国巴克纳Buchner兄弟用石英砂磨碎酵母细胞，制备了不含酵母细胞的抽提液，并证明此不含细胞的酵母提取液也能使糖发酵，说明发酵与细胞的活动无关。从而说明了发酵是酶作用的化学本质，为此Buchner获得了1911年诺贝尔化学奖。1896年,日

3、本的高峰让吉首先从米曲霉中制得高峰淀粉酶,用作消化剂,开创了有目的的进行酶生产和应用的先例。1878年, Khne给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个字来自希腊文，其意思“在酵母中”。后来对酶的作用机理及酶的本质做了深入研究，1894年，Fisher提出了酶与底物作用的“锁匙学说”1903年，Henri提出了酶与底物作用的“中间复合物学说”。1913年，Michaelis和Mentenn导出了米氏方程。1925年，Briggs和Handane提出了稳态学说。1926年，Summer从刀豆中提取脲酶结晶。1930年，Northrop和Kunitz证实酶是一种蛋白质；Summer和Northr

4、op1949年同获诺贝尔奖80年代初发现了具有催化功能的RNA核酶(ribozyme)，这一发现打破了酶是蛋白质的传统观念，开辟了酶学研究的新领域。现已鉴定出4000多种酶，数百种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。什么是酶？酶是生物催化剂生物体一切生化反应都需酶催化才能进行！性能远远超过人造催化剂定义：由活细胞产生的、 有高度专一性和 高效催化作用的生物大分子。 具复杂空间构象，包括蛋白质和核酸。一、酶催化作用的特点 1. 提高反应速度，不改变反应的平衡常数; 2. 只起催化作用，本身不消耗； 3. 降低反应的活化能。 （一）酶与一般催化剂的比较共性：区别：酶作为催化剂比一般催化剂更显著的

5、降低活化能，催化效率更高。 活化能(activation energy) 指在一定温度下，1mol底物全部进入活化态所需要的自由能 单位：KJ/mol酶催化反应的实质：降低反应的活化能1. 酶易失活（温和性）（二） 生物催化剂的特点常温、常压、中性酶是细胞产生的生物大分子，凡能使生物大分子变性的因素，如高温、强碱、强酸、重金属盐等都能使酶失去催化活性。因此，酶催化的反应往往都是比较温和的条件下进行。2. 酶具有很高的催化效率（高效性）且无副反应反应速度是无酶催化/普通人造催化剂催化反应速度的1061016倍。ReactionEnzymeUncatalyzed Rate, vu (sec-1)

6、Catalyzed Rate, ve (sec-1) ve/vu Alkaline phosphatase1 x 10-15141.4 x 1016Urease3 x 10-103 x 1041 x 1014Chymotrypsin1 x 10-101 x 1021 x 1012Glycogen + Pi Glycogen + Glucose-1-P(n) (n - 1)Glycogen phosphorylase3.2 x 1011Glucose + ATP Glucose-6-P + ADPHexokinase1 x 10-131.3 x 10-31.3 x 1010Alcohol deh

7、ydrogenase4.5 x 106CO2 + H2O HCO3- + H+Carbonic anhydrase10-21051 x 107Creatine + ATP Cr-P + ADPCreatine kinase1.33 x 104酶催化反应与非催化反应的比较 酶的催化双氧水裂解酶的转换数（也就是酶的催化常数kcat)一定条件下每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，或每秒每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数。大多数酶对它们的天然底物的转换数的变化范围为每秒1到104（表8-2）3.酶具有高度专一性（专一性）Specificity: 酶对催化的反应和反应物有 严格的选择性。底物（Substra

8、te): 酶作用的物质。酶往往只能催化一种或一类反应，作用于一种或一类物质。一般的催化剂没有这样的严格的选择性。酶作用的专一性是酶最重要的特点之一，也是和一般催化剂最主要的区别（1）酶浓度的可调性 a. 合成调节诱导/阻遏。 b. 降解调节。 （2）通过激素调节酶活性 如乳腺中乳糖合成酶 （3）反馈抑制调节酶活性 （4）抑制剂和激活剂 （5）其他调节方式，如别构调控、酶原激活、共价修饰、同工酶等 4. 酶活性受到调节和控制（可调节性）二、酶的化学本质及分类经酸碱水解终产物是AA能被蛋白酶水解而失活酶可变性失活酶是两性电解质具有不能通过半透膜等胶体性质具有蛋白质的化学呈色反应化学本质是蛋白质（一

9、）酶的化学本质除有催化活性的RNA（核酶）之外。1982年T.Cech发现了第1个有催化活性的天然RNAribozyme（核酶），以后又陆续发现了真正的RNA催化剂。但是必须指出不是所有的蛋白质都是酶，只是有催化作用的蛋白质，才称为酶。另外，蛋白质酶的空间结构对它们的催化活性是必需。 单纯酶 ：只有蛋白质 结合酶（缀合酶）：脱辅酶 + 辅因子辅因子辅基辅酶与酶结合紧，如细胞色素氧化酶中的铁卟啉与酶结合松，可透析除去，如辅酶I和辅酶II全酶（二）酶的化学组成酶和蛋白质一样，相对分子质量很大，一般从一万到几十万甚至上百万。羧肽酶NADPH脱氢酶的辅酶过氧化氢酶结合酶中： 单独酶蛋白或辅助因子没有催

10、化活性一种酶蛋白一般只与一种辅助因子结合同种辅助因子可与不同的酶蛋白结合 酶蛋白：决定反应的专一性辅助因子：传递电子、原子或某些 化学基团的作用MetalIonEnzymeFe2+ or Fe3+Cytochrome oxidaseCatalase PeroxidaseCu2+Cytochrome oxidaseZn2+DNA polymeraseCarbonic anhydrase Alcohol dehydrogenaseMg2+HexokinaseGlucose-6-phosphatase Mn2+ArginaseK+Pyruvate kinase(also requires Mg2+)

11、Ni2+UreaseMoNitrate reductaseSeGlutathione peroxidase金属离子作为一些酶的辅因子单体酶：一般由一条肽链组成，较少，多数为水解酶寡聚酶：为寡聚蛋白，2个亚基（多为偶数），多数酶聚合形式是活性型，解聚形式是失活型。一般是调节酶。多酶复合体：几种酶靠非共价键，彼此嵌合而成。由数个独立的酶组合起来形成络合体，催化一系列反应。（如糖代谢、脂代谢）（三）单体酶、寡聚酶、多酶复合体根据酶蛋白分子的特点：三、酶的命名和分类（一）习惯命名法根据其催化底物来命名；根据所催化反应的性质来命名；结合上述两个原则来命名，有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点。优点

12、 命名简单应用历史较长，使用方便缺点一名数酶、一酶数名为了适应酶学发展的新情况，国际酶学会议于1961年提出一个新的系统命名法及分类原则，已被国际生化协会采用。（二）国际系统命名法：系统名称包括底物名称、反应性质，最后加一个酶字。 底物1 ：底物2 + 反应性质+酶 乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+乳酸：NAD+氧化还原酶当底物为水时，可省略系统名：包括所有底物的名称和反应类型。乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+乳酸：NAD+氧化还原酶惯用名：只取较重要的底物名称和反应类型。乳酸：NAD+氧化还原酶乳酸脱氢酶对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。（三）

13、国际系统分类法及酶的编号1961年国际酶学委员会（Enzyme Committee, EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类（见下页）。分别用1、2、3、4、5、6来表示。再根据底物中被作用的基团或键的特点将每一大类分为若干个亚类，每一个亚类又按顺序编成1、2、3、4等数字。每一个亚类可再分为亚亚类，仍用1、2、3、4编号。每一个酶的分类编号由4个数字组成，数字间由“.”隔开。酶的系统编号：4位数字第一位：代表六大类反应类型第二位：亚类（作用的基团或键的特点）第三位：亚亚类（精确表示底物/产物的性质）第四位：在亚亚类中的序号乳酸脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27第1大类，氧化还原

14、酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的编号亚类及亚亚类的编号代表何种意义可参照书上表8-9 酶的分类酶学委员会氧化-还原酶催化氧化-还原反应，催化氢的转移或电子传递。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。1、氧化还原酶 OxidoreductaseAH2 + B（O2）A + BH2（H2O2，H2O）（四）六大类酶的特征（1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应AH2 +BA +BH2（需辅酶或辅酶）（2）氧化酶类催化底物脱氢，氧化生成H2O2：AH2 + O2A + H2

15、O2（需FAD或FMN）催化底物脱氢，氧化生成H2O：2AH2 + O22A + 2H2O（3）过氧化物酶ROO + H2O2RO + H2O + O2（4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）O2 +OHOHC=OC=OOHOH（顺，顺-已二烯二酸）RH + O2 + 还原型辅助因子ROH + H2O + 氧化型辅助因子（又称羟化酶）转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。根据X分类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。2、转移酶 TransferaseAX + BA +BX水解酶催化底物的加

16、水分解反应。大多属于细胞外酶，主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：3、水解酶 hydrolaseAB + H2OAOH + BH裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。4、裂合酶 LyaseABA + B异构酶催化各种同分异构体的相互转变，即底物分子内基团或原子的重排过程。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应5、异构酶 IsomeraseABPP合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。例如，丙酮酸羧化酶催化

17、的反应。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸6、合成酶 Ligase or SynthetaseA + B + ATPAB + ADP +PiA + B + ATPAB + AMP +PPi指酶对底物的选择性，也称特异性。结构专一性立体异构专一性绝对专一性相对专一性族专一性键专一性旋光异构专一性几何异构专一性四、酶的专一性（一）酶的专一性绝对：仅催化一种底物反应，如脲酶相对：能作用于和底物结构类似的物质族对键旁两端基团要求程度不同， 又称为基团键仅对键有要求，如酯酶旋光异构：对构型有要求，如L-氨基酸氧化酶几何异构：只作用于顺式或反式异构体 如延胡索酸（反丁烯二酸）酶族专一性：可作用于一些结构很相似

18、的底物RCOO- +R OH + H+酯酶：RCOR + H2OOOCH2OHOHOHOH15-葡萄糖苷酶OR+H2OOCH2OHOHOHOHOH15+ ROH绝对专一性：只能作用于某一底物脲酶：H2NCNH2 + H2OO2NH3 + CO2键专一性：可作用于一类很相似的底物（1）锁钥学说刚性构象（2）诱导契合学说（3）结构性质互补学说 静电效应、极性相同（4）三点附着学说 立体异构专一性的酶（二）与酶专一性有关的学说锁钥学说认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样该学说的局限性不能解释酶的逆反应。因为酶不可能即适合于可逆反应的底

19、物，又适合于可逆反应的产物。诱导契合学说酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状. （Koshland，1958）：当底物和酶接触时，可诱导酶分子的构象变化，使酶活性中心的各种基团处于和底物互补契合的正确空间位置，有利于催化。羧肽酶的诱导契合模式“三点结合”的催化理论酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。（一） 酶活力的测定 酶活力也称为酶活性，就是酶催化化学反应的能力 能催化多快的反应 通常以测出的酶促反应速度表示 五、酶的活力测定和分离纯化单位时间内底物的减少或产物的增加1.酶活力产物浓度变

20、化曲线用哪一个速度来表示酶促反应的速度特征呢？反应初速度 Vo反应初速度表示酶活力酶活力可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示，两者呈线性关系。酶催化的反应速率越大，酶的活力越高。因此测定酶促反应的速率就可知酶活力，由于底物一般过量浓度减小不易测定，所以一般测定产物增加量。2.活力单位 (U) 酶单位（U）： 在一定条件下、一定时间内、将一定量的 底物转化为产物所需的酶量。如： 每小时催化1克底物 每小时催化1ml某浓度溶液 每分钟催化1ug底物一定时间一定量底物一定条件下酶活力的大小即酶含量的多少，用酶活力单位表示，即酶单位 在标准条件下（25 ，最适pH和最适底物浓度）一分

21、钟内催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。 1 IU= 1 mol / min 酶活力单位标准化（1）国际单位（IU） 在标准条件下（25 ，最适pH和最适底物浓度）每秒钟催化1摩尔底物转化为产物所需的酶量。 1 Kat =1 mol/s = 60106 IU酶活力单位标准化（2）Kat每mg酶蛋白所含的酶活力单位数。 比活力=活力U/mg蛋白=总活力U/总蛋白mg代表酶的纯度。比活力越大，纯度越高酶产品质量评价中常使用，3.比活力 (specific activity) 测定完成一定量反应所需的时间 测定单位时间内酶催化的化学反应量（1）分光光度法： 利用底物/产物光吸收性质不同 选择适当波

22、长来测定。 （酶偶联分析法）（2）荧光法： 利用底物/产物荧光性质的差别。紫外/可见光4. 酶活力的测定方法优点：高灵敏度；缺点：易受干扰（3）同位素测定方法： 放射性同位素标记底物， 经酶作用得到相应产物， 经适当分离，测定产物脉冲数即可。（4）电化学法： 包括pH测定法，离子选择电极法等。 前者跟踪反应过程中H+的变化， 后者用氧电极测定一些耗氧的酶反应。优点：灵敏度极高；缺点：放射性酶活力测定实例确定反应条件 20、pH=7，底物浓度 6g/L（过量）， 加入2mg固体脂肪酶确定活力单位 每小时催化1克底物 1u= 1g/h 测反应初速度 作产物甘油随时间增加的曲线， 量出反应初速度值

23、， 换算为脂肪的消耗速度。如 8g/h换算活力 8g/h / 1g/h=8u计算比活 8u/2mg酶蛋白=4u/mg酶蛋白脂肪脂肪酶甘油 + 脂肪酸（二）酶的分离和纯化衡量分离提纯效果的两个指标：总活力的回收（回收率）是表示提纯过程中酶的损失情况比活力提高的倍数（纯化倍数）是表示提纯方法的有效程度分离纯化方法同蛋白质纯化类似：1.选材：酶含量丰富的新鲜生物材料2.破碎：因材料而异，制成组织匀浆。3.抽提：低温下以水或低盐缓冲液抽提4.分离及纯化：粗分级，细分级分离5. 结晶6.保存：低温下酶粉可长期保存注意低浓度酶溶液易变性酶的制备过程中，每步都应进行鉴定常用的鉴定指标为：回收率每次总活力10

24、0 /第一次总活力纯化倍数=每次比活力/第一次比活力 产率酶的纯度鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法等电聚焦电泳法六、核酶（ribozyme)（一）核酶：具有催化活性的RNA (1) 19821985年，Cech首先发现四膜虫 的rRNA前体内含子L19RNA既有RNA酶活性，又有RNA聚合酶活性。 随后的研究表明： L19RNA具备酶促催化的几个特征： 高度的底物专一性 遵循Michaelis-Menten动力学 对竞争性抑制剂的敏感性 (2) 1992年，Piccirilli等发现L19RNA具有氨酰酯酶的活性，催化氨酰酯水解。 (3) L19RNA还有限制性内切酶作用： -CpUpCpUpN-

25、+ G -CpUpCpU +GpN (4) 1997年，Zhang和Cech用人造的RNA分子催化合成了肽链，表明RNA具有肽基转移酶活性。 (5) 原核生物RNaseP和 兔肌1，4- -葡聚糖分枝酶催化tRNA前体5端成熟均包括RNA+蛋白组分，起催化作用的都是RNA。（二）核酶的种类（自我催化） 自我剪切： 是转录后加工方式之一 （self- cleavage） 自我剪接 （self-splicing） 需要鸟苷和Mg2+参与不需要鸟苷的参与剪切与连接催化分子内反应in cis核酶的典型结构特点： 三个螺旋 13个保守碱基 剪切点：GUN XRNA既能携带遗传信息 又有生物催化功能。RN

26、A可能早于蛋白质和DNA， 是生命起源中首先出现的生物大分子（三）核酶的研究意义与应用前景利用锤头结构就可以设计自然界不存在的核酶，可定点切割任何一种靶RNA分子。这可用于临床治疗 切割癌基因、致病病毒基因生物催化分子进化的可能过程：RNARNA-蛋白质蛋白质-RNA蛋白质-辅酶（辅基）蛋白质是具有催化作用的抗体本质是免疫球蛋白 在易变区被赋予酶的属性， 又被称为催化性抗体。基态底物过渡态底物七、抗体酶（abzyme)催化的实质是专一结合的相互作用形成过渡态，因此，用过渡态的类似物作为半抗原免疫动物将可能产生有催化活性的抗体。抗体酶 （过渡态底物的抗体） 1986年，Schultz与Lerne

27、r同时得到了具有催化活性的抗体； 证实该抗体酶具有抗原结合位点的Fab片段单独具有全酶一样的催化效率。酶工程：酶制剂在工业上的大规模生产及应用。 普通酶工程、化学酶工程、生物酶工程普通酶工程 单纯生物提取化学酶工程1、微生物发酵得到粗酶2、对天然酶进行化学修饰、固定化处理， 利用化学合成等手段来改善酶性能。八、酶工程简介 A 修饰酶的功能基团： 亲核的Ser、Cys、Thr、Lys、His， 亲电的Tyr、Trp 可氧化的Tyr、Trp、Met 经过修饰的酶稳定性好。（1）化学修饰酶B 交联反应： 用双功能试剂使酶分子间或分子内发生交联反应，经过交联后的酶对热变性和蛋白质水解酶的稳定性增加。也

28、可将不同酶交联成杂化酶，更有利于级联反应的催化。C 大分子修饰作用：可溶性高分子化合物如肝素、葡聚糖、聚乙二醇可修饰酶蛋白的侧链，提高酶的稳定性，改变酶的一些重要性质。例如 淀粉酶经化学修饰连接上葡聚糖后，热稳定性增加，使用寿命延长了30倍。 酶的固定化是把水溶性酶经物理（吸附法与包埋法）或化学方法（共价偶联法与交联法）处理后，使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态。（2） 固定化酶物理法化学法吸附法包埋法共价偶联法交联法固定化优点：稳定性提高，增加了酶的使用寿命，可简化工艺，反应后易与反应产物分离，酶易于分离重复使用。溶液状态固定化（吸附、共价结合、交联、包埋）载体（海藻酸钙

29、、琼脂、卡拉胶、壳聚糖）酶吸附法：使酶被吸附于惰性固体的表面，或吸附于离子交换剂上。包埋法：使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中。偶联法：使酶通过共价键连接于适当的不溶于水的载体上交联法：使酶分子依靠双功能基团试剂交联聚合成“网状”结构 固定化葡萄糖异构酶葡萄糖 果糖42%高果糖玉米糖浆：215万吨/年55%高果糖玉米糖浆：145万吨/年近年来，以固定化微生物组成的生物反应器已获得工业应用。例如固定化酵母反应器连续发酵生产酒精、啤酒。 难度大，产品活性低，发展缓慢。（3）化学合成酶（人工模拟酶）：生物酶工程利用DNA重组技术改造和生产酶的工程方法。外源酶基因工程菌重组入优点？不受天然来

30、源限制，迅速，且易于诱变改造酶产品外源基因生物体中存在的酶基因 克隆酶修饰基因 定点突变酶人工设计合成的基因 新酶1酶是 产生的，具有催化活性的 。2酶具有 、 、 和 等催化特点。3全酶由 和 组成，在催化反应时，二者所起的作用不同，其中 决定酶的专一性和高效率， 起传递电子、原子或化学基团的作用。4辅因子包括 和 等。其中 与酶蛋白结合疏松，可以用 除去。 与酶蛋白结合紧密，需要 除去5Cech和Altman因各自发现了 而共同获得1989年的诺贝尔奖（化学奖）。6根据国际系统分类法，所有的酶按所催化的化学反应的性质可分为六类 、 、 、 、 和 。7根据国际酶学委员会的规定，每一种酶都有

31、一个唯一的编号。醇脱氢酶的编号是EC1.1.1.1，EC代表 ，4个数字分别代表 、 、 和 。8酶的专一性可以分为 和 。 9酶活力是指 ，一般用 表示。10.脲酶只作用于尿素，而不作用于其他任何底物，因此它具有 专一性；甘油激酶可以催化甘油磷酸化，仅生成甘油-1-磷酸一种底物，因此它具有 专一性。11.判断一个纯化酶的方法优劣的主要依据是酶 和 .1关于酶的叙述哪项是正确的？A所有的酶都含有辅基或辅酶B只能在体内起催化作用C大多数酶的化学本质是蛋白质D能改变化学反应的平衡点加速反应的进行E都具有立体异构专一性（特异性）2下列关于酶蛋白和辅因子的叙述，哪一点不正确？A酶蛋白或辅因子单独存在时

32、均无催化作用B一种酶蛋白只与一种辅因子结合成一种全酶C一种辅因子只能与一种酶蛋白结合成一种全酶D酶蛋白决定结合酶蛋白反应的专一性E有些辅因子直接参加反应 3酶与一般催化剂的不同点，在于酶具有：A酶可改变反应平衡常数B极高催化效率C对反应环境的高度不稳定D高度专一性 4酶的专一性可分为：A结构专一性B相对专一性C立体异构专一性D绝对专一性1测定酶活力时，底物浓度不必大于酶浓度。2测定酶活力时，一般测定产物生成量比测定底物消耗量更为准确。3对于可逆反应而言，酶既可以改变正反应速度，也可以改变逆反应速度。4酶只能改变化学反应的活化能而不能改变化学反应的平衡常数。5酶活力的测定实际上就是酶的定量测定。6由1g粗酶制剂经纯化后得到10mg电泳纯的酶制剂，那么酶的比活较原来提高了100倍。在很多酶的活性中心均有His残基参与，为什么？- 酶蛋白分子中组氨酸的侧链咪唑基pK值