基因结构与表达分析的基本策略ppt课件

1、1基因构造与表达分析的根本战略Strategy for Structure and Expression Analyses of Genes分子生物学系22分子生物学的三大中心技术DNA序列分析DNA测序，1977聚合酶链式反响DNA扩增，1985DNA重组技术基因克隆，19733一、DNA序列分析二、核酸分子杂交三、聚合酶链式反响四、基因芯片和微阵列五、 Western免疫印迹主要内容4一双脱氧末端终止法 (Sanger ,1977)一、DNA序列分析二DNA自动化序列分析三化学降解法(Gilbert ,1977)5Frederick Sanger1918 Walter Gilbert193

2、2 The Nobel Prize in Chemistry 1980Paul Berg19266DNA测序技术根底：高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE技术，可分别差别仅1个碱基的单链寡核苷酸DNA片段。 7(一双脱氧末端终止法dideoxy chain termination 8ATP、dATP和ddATP的构造ATPAOHOHHHdATPddATPNTP: 核苷三磷酸ATP、GTP、 CTP、 UTP的合称；dNTP: 脱氧核苷三磷酸dATP、dGTP 、dCTP、dTTP；ddNTP: ddATP、ddGTP、d

3、dCTP 、ddTTP；9掺入N个核苷酸DNA合成反响方式图10DNA单链模板引物 掺入ddNTP延伸的新合成链 末端终止111. 双脱氧末端终止法原理 DNA合成反响中，ddNTP不存在3-OH末端，故不能与下一个核苷酸的5-磷酸基团构成3，5-磷酸二酯键，导致DNA新链的延伸提早终止于ddNTP 。12ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTPA G C T5 T4711G A A T G A 3ACGCT132. DNA测序主要步骤14A反响管G反响管G反响管T反响管C反响管T反响管1516 G A T C17 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 单链DNA模板的制备

4、DNA模板与测序引物退火 掺入法标志反响 延伸-终止反响 放射自显影 阅读测序结果测序步骤 18二DNA测序自动化原理 采用4种不同的荧光分别标志4种ddNTP终止反响产物，替代放射性同位素标志是实现DNA测序自动化的根底。19ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTP5 TG A A T G A 3ACGCT2021表示一个SNP位点，该位点出现了双峰，对应的核苷酸分别为C和T,因此该位点为CT杂合型，假设该位点只需一个峰C或者T，那么该位点基因型为CC或TT纯合型22DNA自动测序步骤 4种不同荧光染料标志终止物ddNTPsSanger测序反响反响产物同一泳道

5、电泳分别 激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子，发射出四种不同波长的荧光 荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序23Dye labeled dideoxyterminators on ABI 3730 capillaries 24 与末端终止法不同，化学降解法是建立在对原有DNA的化学降解过程根底上。 三化学降解法25 将待测DNA片段3或5端进展同位素标志，标志的DNA片段分成五个反响，分别用不同的化学试剂处置，呵斥碱基特异性切割，使DNA片段分别于某一种类碱基处断裂。电泳分别5组DNA混合物，放射自显影检测末端标志的DNA链的电泳区带位置。化学降解法原理26 化学降解G反响方式图 硫酸

6、二甲酯哌啶MetMetMetMet27最新测序技术454技术(Roche )焦磷酸测序Pyrosequencing Solexa测序技术(Illumina )SOLiD技术(ABI )衔接法测序28举例：Solexa测序HiSeq 200029Solexa 测序：在一个反响中同时参与 4 种核苷的标签，采用边合成边测序 SBS sequencing by synthesis 。 完成人类基因组草图不同测序仪的比较图30二、核酸分子杂交Nucleic Acid Hybridization 一Southern印迹杂交：检测DNA (Southern blot hybridization) Sout

7、hern EM , 1975二Northern印迹杂交：检测RNA (Northern blot hybridization) Stark GR，197731核酸分子杂交原理 标志的单链核酸探针与待检测的靶单链DNA或RNA部分互补结合构成杂交双链。 运用：核酸靶DNA或RNA序列的定性与定量分析。323333印迹技术 利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。 这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting, 译为印迹技术。3434探针技术 用放射性核素、生物素或荧光染料标志其末端或全链的知序列的多聚核苷酸链被称为“探针。 探针可以

8、与固定在NC膜上的核苷酸结合，判别能否有同源的核酸分子存在。 35Southern印迹杂交原理 将电泳分别的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标志的核酸探针进展杂交的过程。 一Southern印迹杂交运用：DNA基因组DNA分子的定性或定 量分析。361. 制备基因组DNA2. 用限制性内切核酸酶消化基因组DNA 3. 琼脂糖凝胶电泳分别DNA酶切片段4. 凝胶预处置如强碱，DNA双链变为单链 5. Southern 印迹转移 6. 标志核酸探针、探针与DNA片段杂交7. 杂交结果显示 Southern印迹杂交根本过程37Southern印迹杂交表示图38 将电泳分别的

9、待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标志的核酸探针进展杂交的过程。 3940地中海贫血的Southern blot 基因诊断1仅一条染色体上的一个基因缺失或缺陷，那么链的合成部分受抑制，称为+地贫；2每条染色体上的2个基因均缺失或缺陷，称为0地贫； (3) 1、2序列根本一致；基因不同程度的缺失可引起不同类型的地中海贫血。12+ + +0 + 0 0 041BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe地中海贫血的直接基因诊断42 / /- /- - - /- - - - / - - 正常 缺1 缺2 缺3 缺414kb10kb43二Northern印迹杂交

10、(Northern blot hybridization) 指将RNA变性及电泳分别后，并转移到固相支持物上，用杂交反响来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。 用于mRNA进展定性和定量分析。 44RNA琼脂糖凝胶电泳3kb0.4 kbNt36382604623Northern blot hybridization28S18S运用举例45GAPDH0d 2d 4d 6d 8dNorthern blot 杂交分析mRNA的表达靶 mRNA3-磷酸甘油醛脱氢酶 4646三、其他杂交技术1. 斑点杂交 (dot blot hybridization 将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或

11、尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研讨。47472.原位杂交in situ hybridization 用标志的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸互补序列杂交，可对核酸进展定性、定位和相对定量分析。 48 3核酸酶S1 维护分析法 (nuclease S1 protection assay 单链DNA探针与待测RNA构成DNA/RNA杂交双链，参与核酸酶S1专注性地降解未构成杂交体的DNA或RNA单链，DNA/RNA杂交双链那么遭到维护而不被降解。 494RNA酶维护分析法 RNase protection assay，RPA50RPA根本程序：待测RNA的分别体外转录标志R

12、NA探针待测RNA与探针RNA进展液相杂交 RNA酶消化不同大小杂交片段凝胶电泳分别51三、聚合酶链式反响(Polymerase Chain Reaction, PCR)一PCR技术原理二耐热DNA聚合酶三PCR引物及设计原那么四PCR条件的优化 五PCR改良技术六其它PCR技术52聚合酶链式反响(PCR) :一PCR技术原理 Mullis K. 1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程的核酸体外扩增技术。 The Nobel Prize in Chemistry 1993 53The replication of DNA54 原理：PCR是模拟天然DNA复制过程，利用DNA 聚合酶催化一对

13、引物间特异DNA片段合成的体外扩增技术。 其主要热循环过程为：变性、退火、延伸三个步骤。551. PCR循环由三步组成： 变性denaturation退火annealing延伸extension高温适宜温度适宜温度5657582. PCR扩增终产物大小: 介于两条退火引物5末端之间的双链DNA片段。循环一59循环二60循环三61一对引物：正向和反向限制了PCR扩增的片段的范围5/5/3/3/5/5/3/3/62 5CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGC AGAACA

14、TGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG AGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCG 3GGTCCAGTACTACTACCCGTAGAACATGGTGCGCAGGTT 3. 引物设计实例63

15、 Y=A1+En Y: 扩增产物的量 A: 最初靶DNA分子数 E: PCR扩增效率 n: 循环次数3. PCR产量 当E100, A=1时 Y=2n 2n(引物延伸产物的量64二平台期与平台效应1. 平台效应plateau effect： PCR经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入线性增长期或静止期，即平台效应。影响要素： 引物及dNTP底物浓度降低。 酶与模板比例下降。65PCR平台效应66二耐热DNA聚合酶Taq DNA聚合酶实现了PCR自动化 从嗜热水生菌thermus aquatics YT-1株中直接分别出来。 95的半衰期: 40 min 最适温度: 72 8

16、0 催化反响速率: 150300核苷酸 / 秒/ 酶分子6768Taq DNA聚合酶特性： 53聚合酶活性； 53外切酶活性； 较弱的非模板依赖性； 缺乏35外切酶活性。69PCR thermal cycler70PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析500bp400bp200bp300bp1000bp600bp700bp800bp900bpMarkerPCR产物71无机离子及抑制剂的影响 Taq DNA聚合酶的活性对Mg 2+ 浓度和单价离子K+或NH4+的性质和浓度较敏感。 最适Mg 2+浓度：2 mmol/L K+浓度：50 mmol/L72 几种高保真的耐热DNA聚合酶 1. Tth DNA聚

17、合酶 2. Vent DNA聚合酶 3. Pfu DNA聚合酶73三PCR引物设计原那么引物的化学本质是什么？单链寡核苷酸DNA或RNA片段。DNA复制引物：单链RNA片段PCR引物： 单链DNA片段74PCR引物设计原那么：1.引物与模板的序列要完全互补2.引物与引物之间防止构成稳定的二聚体或发夹构造3.引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反响(错配)755CACTGAACGTAGGCCT3 3GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5特异扩增5CACTGAACGTAGGCCT33GGATCTACATGCGACTTAATCCGGAGATACC5错误引发1. 引物与模

18、板的序列要严密互补2. 引物不能在模板的非目的位点引发 DNA聚合反响(错配)76引物之间应防止3端互补3.引物与引物之间防止构成稳定的二聚体或发夹构造77引物本身不应构成发夹构造784.其它原那么: 引物长度: 1030 nt 碱基分布: A、T、G、C 随机分布 G+C含量：40 60% Tm=4(G+C)+2(A+T) 引物3末端碱基：最好选T、C、G，不选A 防止出现3个以上的延续碱基，如GGG或CCC 引物5末端碱基可不与模板DNA互补791 A260 oligo DNA33gN: 引物碱基数X：合成的oligo DNA A260单位Y：引物的pmol数 106 Ypmol= X33

19、 330 . N X = 105 N 2. 引物用量计算80模板引物Taq DNA聚合酶dNTPMg2+退火变性延伸PCR反响81四PCR条件的优化1. Taq DNA聚合酶浓度： 1.02.5 U/100 l反响液 2. dNTP浓度：20200 mol/L 3. Mg2+浓度：0.52.5 mmol/L 4. 引物浓度：0.10.5 mol/L82五PCR改良技术1. RT-PCR (reverse transcription PCR) 以mRNA为模板逆转录合成cDNA，再以此cDNA为模板进展PCR反响。83RT-PCR原理84逆转录酶 AMVavian myeloblastosis

20、virus 酶活性最适温度42 MMLVMoloney murine leukemia virus：最适温度37 852. 定量RT-PCRQRT-PCR半定量RT-PCR 以样本mRNA为模板逆转录合成cDNA，在不同引物对引导下共同PCR扩增“看家基因和目的基因cDNA 。86 选择内对照基因 组织中普遍表达、表达量比较恒定的“看家基因mRNA。如GAPDH和 -actin mRNA等。 半定量规范 计算PCR 产物 ： 靶cDNA /GAPDH cDNA87 KPNA2在正常生理形状东方田鼠和小鼠体内表达分析88893. 实时荧光定量RT-PCRReal-time fluorescent

21、 quantitative PCR，FQ-PCR PCR扩增指数期内极小的扩增效率改动会极大地影响产量。 运用：用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析。 90荧光染料9192 每构成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去，染料一结合就产生荧光信号，信号强度与DNA分子总数目成正比。93 TaqMan Probe 一种水解式荧光标志探针。寡核苷酸探针的5端标志一个荧光报告基团reporter ，3端标志一个荧光淬灭基团quencher 。94 每产生一条DNA链，就切断一条探针，每切断一条探针，就产生一个单位信号，信号强度与结合探针的DNA分子数成正比。95。 分子信标探针Molecular Beacon Probe 该探针具有发夹构造，5端标志荧光报告基团，3端标志淬灭基团。96探针与靶序列杂交结合，报告荧光染料与淬灭染料分别，发出荧光。97实时荧光定量PCR计算原理PCR扩增效率的差别使一样的样品最终产量有很大差别9899CT或Tc或Ct值： 临界点循环Threshold cycle ，即从基线到指数增长的拐点所对应的循环数100101 传染病诊断、监测与疗效预后评价： 提示疾病发病机制102 荧光定量 PCR仪 带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，配有电脑系统