基因工程原理-第二章DNA重组ppt课件

1、基因工程原理Principle of Gene Engineering 第一章第一节基因工程原理第二章 第二章 DNA重组第一部分 DNA的组成和构造1.1 DNA的组成1.2 DNA的空间构造线形DNA：环形DNA：1.3 DNA复制半保管复制方式复制起始位点replication origin sitebiobar.hbhcgz/Article/ShowArticle.asp?ArticleID=20877 原核生物DNA的复制 解旋酶单链结合蛋白DNA拓扑异构酶引物酶DNA聚合酶DNA衔接酶biobar.hbhcgz/Article/ShowArticle.asp?ArticleID=2

2、0876 真核生物DNA的复制 复制子从复制起始点开场复制出的一个DNA分子或一个DNA片段的核苷酸序列。复制子的数量原核生物的染色体DNA：单个真核生物染色体DNA：多个质粒DNA：单个、多个1.4 DNA转录启动子和转录区的构造启动子：Promotor，DNA分子上能与RNA聚合酶结合并构成转录起始复合体的区域，在许多情况下，还包括促进这一过程的调理蛋白的结合位点。 Pribnow box5-AGGAGG-3SD序列Shine-Dalgarno sequence; SD sequence 1974年，由J.Shine和L.Dalgarno发现SD序列：在细菌mRNA起始密码子AUG上游10

3、个碱基左右处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16SrRNA3端识别，协助从起始AUG处开场翻译。Pribnow box5-AGGAGG-3SD序列1.5 DNA转录终止子transcription terminator终止子Terminator是一段位于基因或支配组末端的DNA片段，可中断转录作用。原核生物拥有两种类型的终止子，包括：本体转录终止子Intrinsic transcription terminators：-依赖转录终止子Rho-dependent transcription terminators：不依赖于蛋白质辅因子就能实现终止作用。依赖蛋白辅因子才干实现终止作用。这种蛋白

4、质辅因子称为释放因子，通常又称因子，与RNA螺旋酶蛋白复合物。两类终止子有共同的序列特征：在转录终止点前有一段回文序列。富含GC回文序列：双链DNA中含有的两个构造一样、方向相反的序列称为反向反复序列，当该序列的双链被翻开后，可构成部分“十字形构造。这段序列被称为回文序列。1.6天然DNA的来源和用途染色体DNA：分别目的基因的主要资料，1000106kb病毒DNA：用于构建基因克隆载体,T4、质粒DNA：用于构建基因克隆载体线粒体DNA：呼吸作用的基因叶绿体DNA：光协作用的基因存在与生物体内的DNA1大肠杆菌源质粒DNA的提取2噬菌体DNA的提取3氯化铯法制备植物基因组DNA1.7 天然D

5、NA的的提取 适宜的生物资料裂解细胞分别DNA纯化核检测1大肠杆菌源质粒DNA的提取松弛型质粒：加氯霉素严紧型质粒：不加氯霉素2噬菌体DNA的提取1.8 DNA的纯化氯化铯-溴化乙锭延续梯度离心法离子交换层析法琼脂糖凝胶电泳洗脱法“基因纯试剂纯化从DNA样品中去掉EB2.2.4 DNA浓缩2.2.5 DNA纯度检测第三次课终了！第二部分 基因工程工具酶基因工程工具酶限制性核酸内切酶DNA衔接酶和激酶DNA聚合酶和RNA聚合酶DNA和RNA修饰酶。一、序列特异的DNA限制性内切核酸酶 (Restriction endonuclease, RE 指可以识别双链DNA分子中特殊核苷酸序列，并使每条链

6、的一个磷酸二酯键断开的核酸内切酶。来源：原核生物种类：500多种作用：把外源DNA切割成片段。第一型Type I：能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解第二型Type II：只催化非甲基化的DNA的水解第三型Type III同时具有修饰及认知切割的作用限制性内切酶的命名和书写：Hind III细菌属名细菌种名菌株酶编号Haemophilus influenzae dRE的功能:防御外源DNA感染,利于遗传的稳定性RE抑制了细菌种属间的交叉繁衍,但甲基化酶的某些误差,又使得不同菌株间DNA的重组成为能够,利于生物的进化.1968年,从大肠杆菌中分别到了I型RE,1970年,从大肠

7、杆菌中分别到了II型RERE的发现：3.1.1限制性核酸内切酶作用机制OH3P-55P3HO1在DNA分子双链的特异性识别序列部位,切割DNA分子,构成链的断裂.识别序列:又叫靶子序列,是由4-8个核苷酸组成的特定核苷酸序列. 3.1.2限制性核酸内切酶的识别序列旋转对称或二重互补对称延续的:例如：5A B C C B A33A B C C B A5延续的:5A B N B A33 A B N B A5EcoR IBamH IGAATTCCTTAAGGGATCCCCTAGG2识别序列在DNA分子上出现的频率例如：识别序列核苷酸个数出现识别序列的几率41/44 （1/256）61/46 (1/4

8、096)DNA长49000bp，Bgl II的识别序列为AGATCT所以实际上在DNA中， Bgl II识别序列应该出现： 49000/4096=12次。 实践上，仅出现6次。同裂酶(isoschizomer)-来源不同,但识别同样的核苷酸靶子序列. 例如:Hpa II和Msp I的识别序列都为5.CC GG.33.GG CC.5 BamH I：5 GGATCC 3Bcl I： 5 TGATCA 3Bgl II ： 5 AGATCT 3 同尾酶(isocaudamer)-来源不同,识别的核苷酸靶子序列不同,但产生一样的粘性末端. 例如:Bam HI, Bcl I, Bgl II是一组同尾酶切割

9、后的末端是GATC.3.1.3 限制性核酸内切酶切割DNA的位点多数在识别序列内部。环形DNA切割后的片段数：N 线形DNA切割后的片段数：N+1DNA片段末端种类：粘性末端：磷酸二酯键断裂位置是交错的平末端：断裂位置在对称轴切割位点表示方法5-CTGCAG-33-GACGTC-5Pst I可以表示为：5-CTGCA G-3反响总体积：20微升酶的用量缓冲液的组成与酶的种类有关反响时间1-3小时。3.1.4限制性核酸内切酶反响系统例： Bgl 对DNA的消化13 mL蒸馏水 2 mL 10 x缓冲液4 mL 底物DNA1 mL RE37，1-3小时依次参与：混匀离心升温，使酶失活6510-15

10、min 除去酶蛋白限制性酶切反响普通流程底物DNA：DNA纯度DNA分子构型识别位点侧面序列位点偏爱DNA甲基化酶的用量酶的活性底物DNA：位点数量规范缓冲液的组成：缓冲液系统MgCl2或醋酸镁NaCl或KClTris-HCl-巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT反响温度：大多数是37，少数或高或低Star活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA。3.1.5 限制性核酸内切酶的Star活性4二、DNA衔接酶DNA衔接酶能催化双链DNA片段紧靠在一同的3-OH和5-P基团末端之间构成磷酸二酯键，使两末端衔接。假设是两个或两个以上不同双链DNA片段末端衔接，那么产生重组D

11、NA分子。3.2 DNA衔接酶缺口nick55335533DNA衔接酶5533DNA衔接酶裂口gap5533nick2酶-AMP复合物中的AMP与DNA链上的5P结合，构成DNA-腺苷酸复合物，P活泼起来33OH对活泼的P作亲核攻击，结果构成磷酸二酯键。1DNA衔接酶与辅助因子ATP或NAD+反响,生成酶-腺苷酸复合物.3.2.1 DNA衔接酶的作用机理E.coli DNA 衔接酶 T4 DNA 衔接酶但效率较低3.2.2 目前常用的DNA衔接酶1条DNA链具有3-OH,另1条DNA链具有5-P,而且3-OH 与5-P是相邻的.3-OH 与5-P位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸的末

12、端.吸能反响: E.coli DNA 衔接酶需求NAD+，T4 DNA 衔接酶需求ATP.3.2.3 DNA衔接酶作用条件缺口nick55335533DNA衔接酶5533DNA衔接酶裂口gap5533反响温度：37酶用量：平末端1-2unit 粘性末端0.1unitATP：10mol/L1mmol/Lbuffer：Tris-HCl，KCl，DTT，BSADNA衔接酶反响条件具互补粘性末端片段之间的衔接具平末端DNA片段之间的衔接DNA片段末端修饰后进展衔接3.2.4 DNA片段之间的衔接方式具互补粘性末端片段之间的衔接具平末端DNA片段之间的衔接DNA片段末端修饰后进展衔接DNA片段末端同聚物

13、加尾后进展衔接粘性末端修饰成平末端后衔接DNA片段5段磷酸化作用后衔接DNA片段末端同聚物加尾后进展衔接粘性末端修饰成平末端后衔接DNA片段5端脱磷酸化作用后衔接5 催化以DNA单链为模板，以4种脱氧核糖核苷酸为底物，合成一条与模板序列互补的DNA新链的酶。三、DNA聚合酶DNA聚合酶包括：大肠杆菌DNA聚合酶I大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段酶T4 DNA聚合酶T7 DNA聚合酶修饰的T4 DNA聚合酶逆转录酶耐热性DNA聚合酶一耐热性DNA聚合酶1956年，美国Kornberg从大肠杆菌中分别出来。由大肠杆菌基因polA编码，单链多肽蛋白质。分子量：109 kD球形，65埃二大肠

14、杆菌DNA聚合酶IE.coli DNA pol I1. DNA聚合酶I反响需求的条件:全部4种脱氧核苷三磷酸,和Mg+. dATP dCTP dTTP dGTP带有3-OH游离基团的引物链. 2. DNA聚合酶I催化的反响(1)聚合反响:53方向DNA聚合酶I催化的聚合反响是在引物链3-OH与dNTP分子的-P-基团间.dNTP接上后,又提供了1个3-OH末端,继续衔接dNTP分子.合成方向是5 3DNA聚合酶I的聚合反响机理引物模板PPi(2) 5 3核酸外切酶活性:pol Ipol I(3) 3 5核酸外切酶活性:polI3、DNA聚合酶I在基因工程中的运用DNA缺口转移nick tran

15、slation反响用于分子克隆。制备高比活的DNA探针。DNA聚合酶I的5-3核酸外切酶活性3355nick3-OH 5-P缺口双链DNA聚合酶I 的聚合活性3355nick3-OH 5-P切去1个5核苷酸在3-OH上加上新的核苷酸3355nick3-OH 5-P32P标志的核苷酸DNA缺口转移线状分子DNaseI切断DNA链DNA聚合酶I 5-3核酸外切酶活性DNA聚合酶I 的聚合活性构成1条具有32P标志的合成DNA链标志探针在5端切去1个核苷酸切出1个缺口在3-OH加上1个32P标志的核苷酸32P标志的核苷酸制备高比活的DNA探针25l1 g纯化的目的基因DNA片段；适量的DNaseI；

16、DNA聚合酶；32P-dNTPs；dNTPs；典型的反响体系：二大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段与DNA末端标志Klenow聚合酶的特点：分子量：76103dal具有聚合酶的活性具有3-5的核酸外切酶的活性。DNA聚合酶IMW：34103 dal： 53核酸外切酶活性。MW：76103 dal：Klenow片段酶，保管DNA聚合酶活性和35核酸外切酶活性。枯草杆菌蛋白酶Klenow聚合酶的运用：cDNA克隆中第二链合成的催化补平双链DNA的3凹端。标志DNA片段的末端：带标志的dNTPDNA序列测定：Sanger末端终止法cDNA的合成第二链DNA的合成加SalI衔接物加EcoRI衔接

17、物与pUC重组cDNA克隆中第二链合成的催化5GATCT 33 A 55GATCT 33 32P-GA 55GATCT 3332P-AGA 5具有3隐蔽末端的DNA片段Klenow酶， 32P-GTP 参与的种类根据5末端决议Klenow酶， 32P-GTP， 32P-ATP补平双链DNA的3凹端。标志DNA片段的末端：带标志的dNTPDNA序列测定：Sanger末端终止法CGTACCTCGTTCATGACAAGCGTCTCAddGAGTddCGCAGAGTddTGTTCGCAGAGTddACTGTTCGCAGAGT*Klenow片段三T4 DNA聚合酶从T4噬菌体中分别的噬菌体基因43编码具

18、有53聚合酶活性具有35核酸外切酶活性，是Klenow片段的200倍左右。取代反响。取代反响特点：当反响混合物中没有dNTP时，T4DNA聚合酶只需3-5核酸外切酶活性，从3-OH端降解DNA。当反响混合物中仅有1种dNTP时，3端降解在暴显露互补的核苷酸时停顿。32P标志的核苷酸5533A T C G T A C A GT A G C A T G T C5533A T C G T A C C A T G T C5533A T C G T A C A GT A G C A T G T GT4 DNA聚合酶，dGTP具有3-OH末端的DNA片段参与32P dNTPs32P标志的核苷酸逐渐取代了外切酶删掉的原有核苷酸取代反响。四反转录酶把RNA转录成DNA的酶。又叫依赖RNA的DNA聚合酶，或RNA指点的DNA聚合酶。1970年发现，在多种肿瘤病毒中发现，常见的AMV鸟类骨髓母细胞瘤病毒的反转录酶。包括： 链：65 103dal 链：95 103dalDNAmRNAprotein转录翻译反转录自我复制酶活性：RNA指点的DNA聚合酶活性DNA指点的DNA聚合酶活性RNase H活性： RNase H是一种专门切割DNA与RNA杂交链上RNA分子的酶RNA模板DNA引物AMVDNARNAAMVAMV 催化以DNA和RNA为模板，以4种三磷酸核苷ATP、UTP、CTP、