时间分辨荧光免疫分析ppt课件

1、5-2 时间分辨荧光免疫分析郑鹄志西南大学化学化工学院开展历程1979年，可标志抗体的Eu3+-二酮体-EDTA1983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测定HCG和磷酸酯酶A“镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配套研讨获2003年度国家科技提高二等奖一、时间分辨荧光免疫分析特点1.荧光衰减时间长镧系元素荧光衰变时间常见荧光物质荧光寿命荧光物质荧光寿命Eu3+714 s非特异性荧光背景1-10 ns人血清白蛋白4.1 ns人球蛋白、血红蛋白3.0 ns细胞色素C3.5 nsFITC4.5 ns丹磺酰氯14 ns苯胺萘磺酸16 ns稀土螯合物104 -106 ns2. Stokes位移大 荧光

2、物质激发波长发射波长Stokes位移Eu-(-NTA)3340 nm613 nm273 nmSm-(-NTA)3340 nm600 nm260 nmTb-(PTA)3295 nm490/543 nm195/248 nmDy-(PTA)3295 nm573 nm278 nm镧系元素发射峰窄优点灵敏度高10-18mol/孔原子标志多标志技术二、时间分辨荧光免疫分析体系非均相时间分辨荧光免疫分析均相时间分辨荧光免疫分析一非均相时间分辨荧光免疫分析时间分辨固相免疫分析解离加强荧光免疫分析酶放大免疫分析1.时间分辨固相免疫分析灵敏度普通不高实例加拿大Cyber Fluor的FIAgen系统Eu3+-BC

3、PDA为标志物2.解离加强分析原理表示图1双功能螯合剂EDTA衍生物、DTTA衍生物、DTPA衍生物一端与镧系离子螯合，一端与抗原/抗体衔接近中性时，螯合物足够稳定酸性条件下，镧系离子迅速、彻底释放Eu-DTTA运用最广泛2加强液加强原理图普通加强百万倍-NTA：Eu(-NTA)3(TOPO)2复合物TOPO：荧光加强协同剂Triton X-100：外表活性剂，构成胶束醋酸：酸性介质3酶放大酶催化底物，生成的产物与溶液中镧系离子、螯合剂生成荧光强、寿命长的三元复合物ALP酶放大免疫分析表示图双标志测定AFP和-hCG-NTA作为螯合剂340 nm 激发，Eu:615 nm, 820 s；Sm:

4、643 nm, 88 s二均相免疫分析基于时间分辨荧光共振能量转移无需洗涤、分别、加加强液TBP-Eu：Eu3+-二吡啶二胺，最大发射615nm，供体APC：别藻蓝蛋白，最大发射665nm，受体能量转移效率最高的供体/受体对时间分辨荧光共振能量转移免疫分析表示图三、时间分辨免疫分析方法夹心法竞争法间接法捕获法生物素-亲和素放大法1. 夹心法双抗体夹心法双抗原夹心法2. 竞争法3. 间接法间接法测定HCV抗体4. 捕获法捕获法测定抗-CMV IgM5. 生物素-亲和素法生物素-亲和素检测PAPP-A四、运用1. 肿瘤标志物检测2. 传染病检测3. 糖尿病检测4. 激素检测5. 细胞活性检测1.肿

5、瘤标志物AFP测定：双抗体夹心法固相包被抗体参与样品或规范品参与Eu标志抗体参与加强液测定荧光灵敏度：0.17 U/ml2. 传染病检测梅毒螺旋体抗体检测：双抗原夹心法强阳性血清和正常人血清分别作为阴阳对照阴性对照、阳性对照和样品参与板上，孵育参与铕标志抗原，孵育参与加强液，检测荧光符合中国药品生物制品鉴定所结果3.糖尿病检测C-肽检测：双抗体夹心法抗体包被微孔板参与规范品或样品参与铕标志抗体加强液，检测荧光灵敏度：0.08ng/ml4.激素检测三碘甲状腺原氨酸T3：竞争法微孔板中参与抗体规范品或样品、铕标志T3参与加强液，测定荧光灵敏度：0.21ng/ml5.细胞活性检测测定细胞活性原理图T：靶细胞E：效