重组骨形态发生蛋白(MBP7-2)在大肠杆菌表达工艺试验报告论

1、重组骨形态发生蛋白（MBP7/2)在大肠杆菌表达工艺试验一 实验目的（1）掌握重组蛋白在大肠杆菌中表达研究的基本方法和基本内容（2）熟悉分子生物学基本实验技术（3）熟悉研究过程培养分析问题解决问题的能力（4）培养完成整套试验流程的能力（5）了解将形态发生蛋白的功能和应用二实验原理细胞破碎 超生破碎：细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。IPTG诱导 E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一

2、个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b半乳糖苷酶催化，转变为

3、半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。（4）常用的电泳方法 （1）醋酸纤维薄膜电泳(cellulose acetate electrophoresis ，CAE ），是以醋酸纤维薄膜作为支持物的一项电泳技术。醋酸纤维分子中每个葡萄糖单位的两个游离羟基均与醋酸脱水缩合，生成二乙酰葡萄糖。常用于血清蛋白、同工酶的分离 （2）聚丙烯酰胺凝胶电泳 不同蛋白质由于带点性质，分子颗粒大小及形状不同，在聚丙烯酰胺凝胶中向极性泳动速度快慢不同，经电泳最终

4、被分离，聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它具有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。而SDS仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白 （3）琼脂糖凝胶电泳 以琼脂糖凝胶作为支持物的一项电泳技术。琼脂糖是半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离作用。常用于血浆脂蛋白、免疫球蛋白、同工酶和DNA 酶切片段的电泳分离 （4）本实验采用SOD电泳的原理 SDS-聚丙烯酰

5、胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量

6、（五）超净工作台的原理四实验步骤质粒的转化从冰箱中取出感受态细胞，冰浴融化细胞在超净工作台中将1ul质粒加入感受态细胞，缓慢混均，冰上放置30min于干式恒温器中，42热击90s,快速将关转移到冰浴中，使细胞冷却5min加入400ul无菌SOC液体培养基，37摇床震荡45min3500r/min离心2min弃上清液，用150ulLB液体培养基重悬感受态细胞将150ul菌液涂布在AMP（100ul|ML）kan(50ul|ml)BL琼脂平板培养基中，倒置平板，37培养箱过夜培养，时间不超过20h种子培养从培养皿中挑选边缘清晰又比较大的菌落接入含LB液体培养基的离心管 中（无菌操作）LB液体培养基

7、的制备蛋白胨1gl氯化钠1g|l酵母提取物5g|l配制100MLLB液体培养基（锥形瓶的选择 培养基体积：锥形瓶体积+1：5）扩大培养将种子液转接入LB培养基中进行扩大培养 五 实验分析六注意事项移液枪的使用注意事项1使用完毕，可以将其竖直挂在移液枪架上，但要小心别掉下来。当移液器枪头里有液体时，切勿将移液器水平放置或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。 2如不使用，要把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。 3使用时要检查是否有漏液现象。方法时吸取液体后悬空垂直放置几秒中，看看液面是否下降。4在调节量程时千万不要将按钮旋出量程，否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。（五）电

8、泳时各个成分的作用1.聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；2.制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择trisHCL系统，具体作用后面介绍；3.TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；4.十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋 白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。染色剂的选择电泳后检测蛋白是否迁移正确与平均，可采用铜染或考马斯蓝染色检测，如果凝胶中的蛋白需要进行转膜则需可逆的铜染法，否则采用不可逆考马斯蓝法染色。铜染法：电泳胶用蒸馏水洗数秒钟，加入0.3 M CuCl2染色5-10分钟，再用去离子水洗一次，在暗背景下观察在兰色胶背景下蛋白出现透明条带，胶置于0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0缓冲液中漂洗脱色两次，再