组织培养学实验ppt课件

1、植物组织培育实验教师：叶水英实验一、熟习和整理植物组织培育实验室一、实验目的： 了解植物组织培育实验室的设置及根本设备，学习根本仪器设备的运用原理与方法，掌握植物组织培育的一些根本技术。二、实验内容：一组培实验室的设置我系组培实验：植物实验室、分子生物实验室、组培室三大个实验室组成。一个规范的组织培育实验室该当包括：预备室、接种室、培育室、驯化室等，预备室又称为化学实验室或通用实验室，可由洗涤室、培育基配制室和灭菌室构成。在实践中可结合可行条件，合并一部分。各分室能满足实验预备器皿的洗涤与存放、培育基制备和无菌操作、器具的灭菌、无菌操作和控制培育三项根本任务的需求。1、预备室由洗涤室、培育基配

2、制室和灭菌室构成。1洗涤室(cleaning room)用于玻璃器皿和实验器具的洗涤、枯燥和储存；培育资料的预处置与清洗；组培苗的出瓶、清洗与整理等。室内应配备大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。备有塑料筐，用于运输培育器皿。备有枯燥架，用于放置枯燥涮净的培育器皿。2培育基配制室用于培育基的配制。要求房间宽阔亮堂、通风、枯燥、清洁卫生，便于多人同时操作；有电源、自来水和水槽池，保证上下水道畅通。有时可将配制室内部间隔为称量分室和配制分室。规模较小时，配制室可与洗涤室合并为预备室。仪器与器具配置：电子天平、磁力搅拌器、蒸馏水器、酸度计、恒温水浴锅、电炉或微波

3、炉、电饭煲、液化气炉灶等、冰箱等仪器设备；移液管或微量移液器、移液管架、培育瓶包括试管、棕色或透明试剂瓶、烧杯带或不带刻度、量筒、容量瓶、培育皿、吸管、打孔器、玻璃棒、标签纸、记号笔、耐高温高压塑料薄膜等封口资料、周转筐、尼龙绳、脱脂棉、纱布、任务台、蒸馏水桶、医用小推车等用品和器具。此外，配备器械柜和药品柜，分别存放接种器具和分类存放化学试剂可改为药品。最好配备防尘设备，以减少灰尘污染。3灭菌室用于培育基、器皿、工具和其他物品的消毒灭菌。要求平安、通风、亮堂；墙壁和地面防潮、耐高温；配备水源、水槽池、电源或煤气加热安装和供排水设备；保证上下水道畅通，通风措施良好。消费规模较小时，可与洗涤室、

4、配制室合并在一同，但灭菌锅的摆放位置要远离天平和冰箱，而且必需设置换气窗或换气扇，以利通风换气。仪器与器具配置：高压灭菌锅、干热消毒柜或烘箱、细菌过滤安装、任务台、培育基存放架或橱柜、周转筐、换气扇、医用小推车等。2、无菌操作室transfering room进展植物资料的接种、培育物的转移等无菌操作，因此接种室也称为无菌操作室。其无菌条件的好坏对组织培育的胜利与否起着重要作用。在任务方便的前提下，接种室宜小不宜大，普通78m2，要求地面、天花板及四壁尽能够密闭光滑，易于清洁和消毒。配置推拉门，以减少开关门时的空气扰动。接种室要求干爽安静，清洁亮堂。在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯，用以照射

5、灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。仪器与器具配置：超净任务台、空调机、解剖镜、接种器具消毒器(或高温焚化炉)、紫外光灯、酒精灯、广口瓶、三角瓶、搪瓷盘、接种工具、手持喷雾器、任务台、搁架、接种用的小平车、不锈钢长方形饭盒(盛放7075%酒精，用于浸泡接种工具)或医院用消毒盒等。配置污物桶，以便存放接种过程中的丢弃物，须每天清洗改换。进入无菌室前，为了防止带菌空气直接进入接种室和任务人员进出接种室时带进杂菌，接种人员在缓冲间更衣、换鞋、洗手、戴上口罩后，才干进入接种室。该当在此室内安装灭菌用的紫外灯。3、培育室culturing room 培育室是将接种

6、的资料进展培育生长的场所。培育室的大小可根据需求培育架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原那么。高度比培育架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。培育资料放在培育架上培育。培育架大多由金属制成，普通 设5、6层，最低一层离地高约l0-20cm，其他每层间隔30cm左右，培育架即高1.7m左右。培育架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，那么长1.3m，30W的长lm，宽度普通为60cm。培育室最重要的因子是温度，普通坚持在2027左右，具备产热安装，并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培育室。

7、室内湿度也要求恒定，相对湿度以坚持在7080为好，可安装加湿器。控制日光照时间可安装定时开关钟，普通需求每天光照1016h也有的需求延续照明。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。4、驯化室驯化室要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调理安装、通风口以及必要的杀菌剂。二组培实验室常用仪器设备1、常用仪器设备1超净台最常用最普及的无菌操作安装,主要经过风机,送入的空气经过细菌过滤安装,再流过任务台面.因此,超净任务台应放置在空气干净,地面无灰尘的地方,以延伸运用期.运用

8、过久,引起堵塞,需求清洗和改换过滤器。2高压灭菌锅是最根本的设备，用于培育基.器械等的灭菌。3空调机保证室内温度，普通为252，应安顿在室内较高的位置。以便于排热散凉。4光照培育箱用于植物资料的特定培育，可以控制温度、湿度及光照等。5烘箱洗净后的玻璃器皿，如需迅速枯燥，可放在烘箱内烘干，温度以80-100为宜假设需干热灭菌，温度升高至150-160 ,继续1-3小时即可6冰箱某些试剂药品和母液需低温保管，有些资料需低温处置，需求运用冰箱7电子分析天平电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品准确度为0.0001g；托盘天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，其准确度为0.1g。

9、天平应放置在枯燥、不受震动的天平操作台上。8显微镜及解剖镜，种类较多，用于分别微茎尖可采用双筒实体解剖镜。双筒解剖镜在分别茎尖等较小组织时，便于察看、操作，通常放大5-80倍。放大40倍以上操作需求有相当熟练的技术和较好的工具。为进展操作，要有照明安装。解剖镜上带有照相安装，根据需求随时对所需资料进展摄影记录。9摇床与转床用于改善液体培育资料的通气情况及促进酶解原生质体的解离。普通在液体培育中转速为每分钟100次左右，在解离原生质体时为每分钟80左右。10磁力搅拌器磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质，如各种化学物质、琼脂粉等。磁力搅拌器还可加热，使之更利于溶解。11培育架进展固体培育和试管苗大量

10、繁衍时,需求有放置培育瓶的培育架。12酸度计组织培育中培育基pH值的准确度是非常重要的，该当运用酸度计，假设无酸度计，也可运用pH试纸进展粗测。13离心机用于搜集原生质体，转速要求较低。普通为10004000rpm即可。三必要的器皿1、玻璃器皿长时间培育和储存药液用的玻璃器皿，要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制成，而且可以耐高压灭菌。1培育器皿装入培育基进展植物资料的培育，根据培育目的和要求不同，可以采用不同种类和规格的玻璃器皿。试管、三角瓶或锥形瓶、培育皿。通常以纱布包被棉花塞，外面再包一层牛皮纸，用线绳或橡皮筋扎好。如今多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。为了添加通气性，可在

11、里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样经济方便，且通气好。也可采用公用的封口膜。以到达防止培育基枯燥和杜绝污染的目的。目前，培育容器和制备培育基所需的玻璃器皿逐渐被塑料器皿所替代。塑料容器具有质轻、透明、不易破碎、本钱低等优点，如培育容器多为平底方盒形，可提高培育空间利用率的植株数，并能一层层地叠摞起来，从而节约空间。这类塑料制品多是采用聚丙烯资料制成，能耐高温，可进展高压灭菌。有些产品为一次性耗费品，不但可节省洗涤人工，还可节省时间，提高效率。一次性塑料容器或带螺丝帽的玻璃瓶，无须另外配盖，运用时比较方便。2盛装器皿配制培育基时，各种药品的溶解，贮藏均需求各种规格的烧杯、试剂瓶等。大烧杯用于培育基的

12、熔化，本钱高，易破，可以用搪瓷盆替代。2计量器皿母液的配制、药液的分装、汲取需求玻璃计量器皿，如10ml、25 ml、50 ml、100 ml、200 ml、500 ml、1000 ml的量筒，25 ml、50 ml、100 ml、200 ml、500 ml、1000 ml、2000 ml的容量瓶，以及0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml、1 ml、2 ml 、5 ml的移液管，用于配制培育基时汲取不同种类的母液。应多预备几支，分开运用。3、其他器皿：如滴瓶、称量瓶、玻璃棒、漏斗、玻璃管、注射器等实验室常用器皿应具备。2、金属器械报告：组织培育常用的金属器械，可选用医疗器械或微生物实验所用

13、的器械。1镊子类：常运用医疗上的镊子。根据操作需求有各种类型，假设用l00ml的三角瓶作为培育瓶，可用20em长的镊子。镊子过短容易使手接触瓶口，呵斥污染。镊子太长，运用起来不灵敏。2剪刀类：可采用医疗五官科用的中型剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。也可以用弯形剪刀，由于其头部弯曲，可以深化到瓶口中进展剪切。3解剖刀切割较小资料和分别茎尖分生组织时，可用解剖刀。刀片要经常互换，使之坚持锋利形状，否那么切割时会呵斥挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培育效果。4接种针用来转移细胞和愈伤组织。四实验器具的洗涤和灭菌1、器皿的清洗植物组织培育最重要的，也是最根本的要求，就是各项操作都应从无毒害、无污染

14、的培育环境来思索。培育过程中最经常、最大量的任务之一，是洗涤培育瓶及其它常用器皿。在清洗器皿处应有较大的水池，水池运用水泥制造，白瓷砖砌内外外表，池底另放一张橡胶垫，以减少器皿破损。自来水龙头宜采用三孔鹅颈式的，用水方便，并在需求时可加装抽滤器。下水道应畅通，以免妨碍任务。除水池外，还需辅助以假设干盆与桶。 最常用的洗涤助剂就是家庭用的洗衣粉及肥皂两种，备一点去污粉也有些用途。假设冷的洗衣粉水效能欠佳，可以添加浓度或适当加热。这已可以处置许多清洗中的问题。没必要运用铬酸-硫酸洗液，由于运用这种洗液要非常小心，而且效率也不高。洗瓶时先将瓶子在清水中泡一会儿，然后在水龙头下涮去瓶内污物，沥干水，泡

15、入浓洗衣粉水中，再用瓶刷沿瓶壁上下刷动和呈圆周旋转两个方向刷洗。瓶外也要刷到，不要留下未刷到之处。刷后放到水龙头下用流水冲刷4次，以彻底冲去洗衣粉残留物。洗好的瓶子应透明锃亮，内外壁水膜均一，不挂水珠，即表示无污迹存在。通常无须乎再用蒸馏水涮一遍，直接置于搁架上沥晾水汽。也可制造晾洗架，瓶子倒放在孔格中或挂在小木棍上，这样洗后要摆一遍瓶子，用时再收一次瓶子。急等运用的瓶子可以用烘箱烘干。烘时缓慢升温，温度也无须太高。新买进的瓶子亦可按上述方法处置。移液管之类的仪器，可用橡皮吸球(洗耳球)和热洗衣粉水吸洗，再放水龙头下流水冲净，垂直放置晾干。带刻度的计量仪器不宜烘烤，以免玻璃变形，影响计量的准确

16、度。如洗后急等运用，只需用要吸量的液体吸弃数次，或用95%酒精吸弃数次后，即可运用。2、灭菌1器皿和器具常用灭菌方法：1、热压灭菌法学习操作将洗净的培育器皿，器具，用牛皮纸包好，放入高压消毒锅中，1.1压力下灭菌2030分钟。2、干热灭菌法洗净的玻璃器皿置于电热枯燥箱中，15040分钟或120两小时，待冷却后运用。二无菌室灭菌接种室、培育室1、用新洁尔灭擦抺任务台，70%酒精擦拭超净任务台。2、薰蒸学习操作用甲醛、高锰酸钾提早13天薰蒸密封房间方法1：甲醛倒入蒸发皿加热，用量10ml/m2。方法2：甲醛HCHO与高锰酸钾KMn4以10：1比例混合。3、接种前用7075%酒精喷雾，使飘在空气中的

17、尘埃堆积下来。4、用紫外光灯进展照射灭菌波长26502660A最好接种箱及器具3040分钟。三培育基灭菌略四培育资料灭菌略五任务人员无菌操作略三、作业：简述我系组培实验室中的各仪器及运用方法。实验二 MS培育基母液的配制与保管一、目的要求：经过MS培育基母液的配制与保管，掌握配制与保管培育基母液的根本技艺。二、资料与器具：配制MS培育基所需的药品、天平、烧杯、容量瓶、量筒、蒸馏水、母液瓶、标签、冰箱等。三、实验步骤：1、母液的配制1母液1的配制：称量：NH4NO3 82.5g，KNO3 95g， MgSO47H2O 18.5g混合：用少量蒸馏水将药品分别加热溶解。然后依次混合。定容：加少蒸馏水

18、定容至1000ml，成50倍液。2母液2的配制：称量：CaCl22H2O 22.0g定容：加蒸馏水定容至500ml，成100倍液。3母液3的配制：称量：KH2PO48.5g 定容：加蒸馏水定容至500ml，成100倍液。4母液4的配制：称量：Na2-EDTA 1.865 g , FeSO47H2O 1.390 g , EDTA：乙二胺四乙酸混合：用少量蒸馏水将Na2-EDTA加热溶解后。再渐渐倒入FeSO4溶液，充分搅拌并加热5分钟，使其充分螯合。定容：加蒸馏水定容至500ml，成100倍液。5母液5的配制：微量称量：H3BO30.31g ，NaMoO42H2O 0.0125g，MnSO44H

19、2O 1.115g CuSO35H2O 0.00125g，ZnSO47H2O 0.43g，CoCl26H2O 0.00125gKI0.0415g混合：用少量蒸馏水将药品分别加热溶解。然后依次混合。定容：加蒸馏水定容至1000ml，成50倍液。6母液6的配制：微量称量：肌醇：5.0g，甘氨酸：0.1g,烟酸：0.025g。VB6 (盐酸吡哆素) 0.025g , VB1盐酸硫氨素0.005g, 混合：用少量蒸馏水将药品分别加热溶解。然后依次混合。定容：加蒸馏水定容至250ml，成200倍液。7植物生长调理物质母液的配制。微量称量：生长素IAA、IBA、NAA、2,4-D或细胞分裂素(KT、ZT、

20、6-BA)50100mg，0.05g0.1g溶解：生长素IAA、IBA、NAA、2,4-D可用少量0.1mol/L的NaOH或95%的酒精溶解，细胞分裂素(KT、ZT、6-BA) 可用少量0.1mol/L的HCI加热溶解。定容：将溶解的生长物质一滴滴倒入不断搅拌的盛有5060ml蒸馏水的小烧杯中，然后倒入100ml容量瓶，用水冲洗小烧杯数次，最后加蒸馏水定容至100ml配制成浓度为0.51mg/ml的溶液。2、母液的保管1装瓶：将配制好的母液分别倒入瓶中，贴好标签，注明培育基称号、母液号、配制倍数或浓度与配制日期。2贮藏：将母液瓶储放在40冰箱内备用。实验三 MS固体培育基的配制 MS培育基是

21、目前运用最普遍的培育基。其具有较高的无机盐浓度，可以保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、储存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。 MS固体培育基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培育，其液体培育基用于细胞悬浮培育时能获得明显的胜利。MS培育基的无机营养的数量和比例比较适宜，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需求。因此，普通情况下，不用再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。和其它培育基的根本成分相比，MS培育基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的显著特点。一、目的和要求：经过MS固体培

22、育基的配制，掌握配制培育基的根本技艺。二、资料与器具：配制MS培育基的各种母液、生长调理物质母液、琼脂粉、蔗糖、蒸馏水、移液管量筒、容量瓶、电炉、酸度计或PH试纸、0.1 mol/L的NaOH、0.1 mol/L的HCI、培育瓶、标签、铅笔等。三、方法与步骤：下面取的量是定容1000ml，每小瓶30ml左右，每人接种4小瓶左右。要多少ml？1、按母液顺序和规定量，用吸管提取母液，放入盛有一定量的蒸馏水的烧杯中。母液1 20ml 母液2 10ml 母液3 10ml 母液4 10ml母液5 20ml(假设是800倍的，母液1.25ml+水18.75ml) 母液6 5ml2、参与生长调理物质：参与的

23、详细调理物质与量，视培育物不同而异，有时也可不加。3、参与固化剂：参与琼脂7g。4、加糖：放入蔗糖30g。5、定容：参与蒸馏水定容至1000ml。如是固体琼脂要加热溶化。6、调整PH值：经酸度计或PH试纸测试，用0.1 mol/L的NaOH、0.1 mol/L的HCI把培育基的PH调整到5.86.0之间。7、培育基分注：把配制好的培育基分注到培育瓶中，100150ml的培育瓶每瓶装入2025ml左右培育基。分注后立刻加盖，贴上标签，注明培育基的称号和配制时间等。实验四、培育基和培育器具的灭菌一、实验目的：1、掌握高温高压湿热灭菌的原理及手提式灭菌锅灭菌操作流程。 2、 探求影响培育基灭菌效果和

24、凝固效果的主要要素。 二、 实验原理：培育基和培育器具普通采用高温高压湿热灭菌法来进展灭菌， 其灭菌原理是利用高温高压产生的蒸汽杀灭微生物的方法， 由于热蒸气具有较强穿透力 ，可使蛋白质凝固而到达灭菌的目的。 培育基高温高压湿热灭菌是压力在 0. 11-0. 15MPa(温度为 121-126 ) ， 坚持该压力 15-30 min， 即可到达灭菌目的。 三、 资料、 仪器与试剂 1、仪器: 高压灭菌锅 2、用 具: 集装框、 手套、 计时器 四、实验步骤 1、洗涤：把组织培育基用 的培育皿、 三角 瓶、 试管等玻璃器皿进展彻底清洗。自 然晾干或烘箱枯燥。 2、包扎：用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔

25、纸把玻璃器皿和金属器械分别包扎好。 3、加水：往锅里加水至浸没发热管( 切忌干烧! ) 。 4、装锅：在灭菌锅内 放入含培育基的培育瓶或三角 瓶、装蒸馏水的玻璃瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金属器械等。 5、封锅、 接通电源: 盖好锅盖， 对角线拧紧螺旋。封锁放气阀和平安阀， 接通电源， 加热。 6、排冷空气：当压力到达 0. 05Mpa 时，翻开手动放气阀放冷气， 将锅内的冷空气全部排出。 或将排气阀开着，加热，直至锅内释放出大量水蒸气( 此时水蒸气横向喷出 ) ，再封锁阀门 。 7、 升温升压: 压力 回零后， 封锁放气阀， 继续加热加压。8、 保温保压: 当压力到达 0. 11Mpa( 温度

26、为 121 ) 时开场计时，使压力坚持在 0. 11-0. 15Mpa( 121-126 ) 之间，维持15-30min。 ( 假设灭菌时间过长，会使培育基中的某些成分变性失效) 9、 断电降温、出锅: 灭菌终了后，断电， 手动缓慢放气到压力为 0. 05 Mpa 时，才干快速放气，当压力降到“ 0 时翻开锅盖， 取出灭菌物品 。 本卷须知: 1、 培育基中含有大量有机物， 尤其是含糖量较高，为各种微生物繁殖和繁衍提供极好场所。 因此，培育基配制好必需尽早( 不能超越 24h) 进展灭菌，以保证植物组织培育的顺利进展。2、灭菌锅运用应留意: ( 1) 先翻开放气阀， 再翻开锅盖。 ( 以免锅内

27、 压力 大而爆炸! ) ( 2) 开盖后应尽快转移培育瓶，使培育瓶冷却、 凝固 。 普通应将灭菌后的培育瓶贮藏于 30 以下的室内 ， 最好贮藏在 4-10 的条件下。 ( 3) 某些生长调理剂如 IAA、 ZT、 ABA 等以及某些维生素遇热是不稳定的， 不能同培育基一同高压灭菌， 而需求进展过滤灭菌。 ( 4) 锅内冷气必需排尽， 以保证灭菌效果。 否那么， 压力表指针虽指到一定压力 ， 但由于锅内冷空气的存在而达不到要求的温度， 很难到达彻底灭菌。 ( 5) 当到达一定压力后， 要严厉遵守灭菌时间。时间过长会使一些化学物质遭到破坏，影响培育基成分; 时间短那么达不到彻底灭菌的目的。实验五

28、 无菌操作技术一、目的和要求：经过在超净任务台上进展无菌操作训练，使学生初步掌握组织培育的无菌操作技术。二、资料与器具：超净任务台、70%酒精、95%的酒精、盛有培育基的培育瓶已灭菌、接种器械主要指解剖刀、剪刀、镊子等、酒精灯、培育资料根、茎、叶或种子等、0.1%的升汞或漂白粉、无菌水等。三、方法与步骤：1、用水和肥皂洗净双手，穿上灭菌过的公用实验服、帽子与鞋子，进入接种室。2、翻开超净任务台和无菌操作室的紫外灯，照射20分钟。3、操作前10分钟使超净任务台处于任务形状，让过滤室空气吹拂任务台面和周围的台壁。4、照射20分钟后，封锁紫外灯，5、用70%的酒精灯擦拭任务台和双手。6、用蘸有70%

29、的酒精的纱布擦拭装有培育基的培育器皿，放进任务台。 7、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的酒精中，在火焰上灭菌后，放在器械架上。8、把培育资料放进70%的酒精中浸泡30秒后。再在0.1%的升汞氯化汞中浸泡10分钟，或在10%的漂白粉上清液中浸泡1015分钟，浸泡时可进展搅动，使植物资料与灭菌剂有良好的接触；然后用无菌水冲洗35次。9、用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到，翻开瓶口。10、取下接种器械，在火焰上灭菌。11、把培育资料放入培育瓶，盖上瓶口每人接种510瓶。操作期间应经常用70%酒精擦拭任务台和双手；接种器械应反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上灭菌。12、接种终了后，清理和封锁超净任务台。防止操作带来的污染A、整个接种操作应在近火焰处进展，且动作要迅速正 确 错 误B、接种过程中尽能够到达悬空要求防止操作带来的污染正 确 错 误C、接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口防止操作带