显微镜的使用及细胞的革兰氏染色

1、微生物学试验报告题目：显微镜的使用及细胞的革兰氏染色姓名： 学号：班级班级：组别：同组者：时间：【试验器材】.菌种大肠杆菌16h牛肉膏蛋白陈琼脂斜面培育物，金黄色葡萄球菌16h牛肉膏蛋白陈琼脂斜面培育物，枯草芽抱/胞杆菌16h牛肉膏蛋白膝斜面培育物。.溶液和试剂革兰氏染液，草酸镂结晶紫染液，卢戈式（Lugol）碘液，95%乙醇，番红复染 液，香柏油，二甲醇等。.仪器和其他用品一般光学显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，双层瓶，接种环，试管架，镶子， 滴管。【目的要求】.显微镜的构造及使用。.学习油镜的使用、涂片、染色技术。.初步熟悉细菌形态。.把握革兰氏染色法。【试验原理】现代一般光学显微镜采用目

2、镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复 式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大局部组成。在一般光学显微镜通常配 置的集中物镜中油镜的放大倍数最大，对微生物学讨论最为重要，与其他物镜相 比，油镜的使用方法比拟特别，需要在载玻片和镜头之间滴加香柏油。简洁染色法是采用单一染料使细菌着色以显示其形态的染色方法。常用于染色的 染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料电离时，其分子染 色局部带正电荷，能和带负电荷的物质结合。由于细菌生长于中性、碱性或弱酸 性的溶液中时常带负电荷，所以通常采纳碱性染料使其着色。当细菌分解糖类产 酸使培育基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸

3、性复红或刚果 红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊 红天青等。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创立的。作为细菌学上最常用 最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法可将全部的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+） 和革兰氏阴性菌（G一）两大类。G一菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类 脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增 加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱 色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质 含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此

4、细菌仍 保存初染时的颜色。【操作步骤】1、简洁染色：(1)涂片：留意取菌不要太多。(2)晾干：自然晾干。(3)固定：手执玻片一端，让菌朝上，通过火焰2-3次固定(以不烫手为宜)(4)染色：涂片加染色剂L5min。(5)水洗：水洗背冲涂片(6)干燥：自然晾干或用吸水纸吸干。(7)镜检：先低倍观看，再高倍观看，并找出适当的视野后，将高倍镜转出, 在涂片上加香柏油，油观看细菌的形态。2、革兰氏染色(1)制片：制片方法与简洁染色相同。(2)初染：加适量(以刚好掩盖菌为宜)的结晶紫染色液染色L5min,水洗。(3)媒染：碘液媒染Imin,水洗。(4)脱色：连续滴加95%乙醇脱色2030s至流出液无色，马

5、上水洗。(5)复染：滴加番红复染L5min,水洗。(6)镜检：干燥后，油镜镜检观看。(7)混合涂片法：多区域同时染色。【试验结果】(1)油镜下观看的混合区菌体图像。金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌枯草芽泡杆菌图1革兰氏染色结果(2)结果纪录表表1结果纪录表菌名菌体颜色菌体形态结果(G+, G-)大肠杆菌红色杆状或球状G-金黄色葡萄球菌紫色球形G+枯草芽狗杆菌紫色杆状G+【思索题】(1)用油镜观看时应留意哪些问题？在载玻片和镜头间香柏油有什么作用？ 答：应领先用擦镜纸将镜头擦洁净，以防上次试验的污染。先低倍再高倍，用完 要擦掉油。加香柏油,作用是增加折光率,也就是增加了显微镜的区分率。油的折 光率和

6、区分率成反比，同时与波长成正比。(2)什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观看中有什么意义？答：在一般状况下，当物像在一种物镜中已清楚聚焦后，转动物镜转换器将其他 物镜转到工作位置进行观看时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜 的同焦(parfocal) o采用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大 倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调整器即可对物像清楚聚焦，从而避开由于 使用粗调整器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。(3)应当如何依据所观看微生物的大小选择不同的物镜进行有效的观看？答：先用低倍镜观看，然后逐步换用较高倍镜，通过调整，始终到视野清楚且范 围足够大，符合试验要求即可。(

7、4)在进行细菌涂片时应留意哪些环节？答：在载玻片上先滴一滴水，再用接种环尖端在菌落或菌苔上蘸一两下然后涂到 水中，此外不要取太多菌种。(5)进行细菌制片时为什么要加热固定？在加热固定时要留意什么？答：防止细菌在染色和冲洗过程中被冲走，留意温度不要过高，以免细菌被杀死。(6)为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观看？答：第一，防止残留的水污染油镜；其次，防止有水混在香柏油中，影响观看。(7)在进行微生物制片时是否都需要进行涂片？为什么？答：不是。由于有些微生物使用液体培育基培育，不需要涂片。(8)对细菌进行单染色时，染色时间对染色效果有何影响？为什么？答：假设染色时间过短，可能染色太浅，影响观看；

8、假设染色时间过长，那么有可能使 细胞结构受到破坏，同时可能颜色太深，影响观看。(9)金黄色葡萄球菌聚集成葡萄串状的缘由是什么？答：金黄色葡萄球菌分裂后，细胞壁相互粘连不分开，使其聚集成葡萄串状。(10)革兰氏染色是否胜利，有哪些问题需要留意，为什么？答：革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色 而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色 时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。染色过程 中勿使染色液干枯。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影 响染色效果。选用幼龄的细菌。假设菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳 性菌转呈阴性反响。(11)现有一株未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定该菌是革兰氏阳性 菌还是革兰氏阴性菌，如何确定你的染色结果的正确性？答：可以在同一载玻