六君子汤对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠免疫功能的影响（

1、PAGE PAGE 6六君子汤对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠免疫功能的影响 基金项目：河北大学自然科学基金资助项目（No.2006Q29）This work was supported by a grant from the Natural Science Foundation ofHebei University（No.2006Q29）刘智勤，女， 硕士，讲师，主要从事药理学和中医药方面的研究，已在该领域发表23篇论文，其中北大核心期刊16篇，联系电话手机E-mail：liuzhiqin006007 刘智勤1，陈鹊汀2，朱惠学3，蒋玉凤4，李 岩

2、1， 黄启福4（1河北大学药学院中药学教研室，河北省药物质量研究重点实验室，河北，保定 071002；2河北大学附属医院肿瘤科，河北，保定 071000；3河北省唐县人民医院外科，河北 072350；4北京中医药大学病理教研室，北京 100029）目的：观察六君子汤对环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）化疗荷瘤小鼠免疫功能的影响。方法：建立S180荷瘤小鼠模型后，随机分为四组，荷瘤对照组、CTX组、六君子汤CTX组及六君子汤组，每组10只，另取10只未荷瘤小鼠作正常对照组。造模次日开始给药，共10天，停药次日处死，测定腹腔巨噬细胞吞噬功能、NK细胞活性、T淋巴细胞和B淋巴细胞的

3、增殖能力。结果：六君子汤可提高化疗荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能和NK细胞活性，同时还对刀豆素A（ConA）诱导的T淋巴细胞增殖以及脂多糖（LPS）诱导的B淋巴细胞增殖均有促进作用。结论：六君子汤具有提高机体免疫功能，抵御化疗所引起的免疫功能下降的作用。关键词:六君子汤；肿瘤；免疫功能；化疗中图分类号:R285.5 文献标识码:A The Influence of Liujunzi Decoction on the Immune Function of Tumor Bearing Mice Receiving CTX ChemotherapyLIU Zhi-qin 1， CHEN Que-tin

4、g ，ZHU Hui-xue3，JIANG Yu-feng4，Li Yan1， HUANG Qi-fu4(1 College of Pharmacy，Hebei University，Hebei Province Key Laboratory of Pharmaceutical Quality Control，Hebei Baoding 071002；Department of Tumor，Affiliated Hospital of Hebei University， Hebei Baoding 071000；3 Department of Surgery，People Hospital o

5、f Hebei Tangxian, Tangxian Hebei 072350;4 Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029)Abstract: Objective To investigate the influence of LiuJunZi Decoction on the immune function of tumor bearing mice receiving cyclophosphamide（CTX） chemotherapy. Methods S180 tumor bearing mice models we

6、re established and then divided randomly into four groups， including control group with tumor，CTX group，LiuJunZi Decoction combined with CTX group，and LiuJunZi Decoction group. Each group had 10 mice. Normal control group conclude 10 normal mice.After 10 days of treatment，the mice in the five groups

7、 were all killed.Phagocytic function of celiac macrophage，NK cytotoxieity，and the function T and B lymphoctyte were determined. ResultsThe results were displayed that LiuJunZi Decoction could improve Phagocytic function of celiac macrophage and NK cytotoxieity of tumor bearing mice receiving CTX che

8、motherapy. And also enhance the proliferation of mouse splenocytes induced by suboptimal concentration of mitogen concanavalin A or lipopolysac. Conclusion These results indicated that LiuJunZi Decoction can regulate the immunosupression on tumor bearing mice after chemotherapy.Key words LiuJunZi De

9、coction；Tumor； Immunity function；Chemotherapy 六君子汤源自妇人良方，是经典的健脾益气、扶正固本的传统方剂，临床应用广泛。现代药理实验证明1六君子汤方中除半夏外，均具有增强机体免疫功能，提高巨噬细胞吞噬功能的作用，方中的人参、白术、甘草和陈皮能提高正常小鼠和免疫抑制小鼠的胸腺细胞E花环形成率。但有关六君子汤对化疗荷瘤小鼠免疫系统的影响报道较少，本研究通过建立S180荷瘤小鼠模型，观察了六君子汤对环磷酰胺（cyclophosphamide ，CTX）化疗荷瘤小鼠免疫功能的影响，旨在为该方的临床应用提供一定实验依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1动

10、物及细胞株 清洁级昆明小鼠50只，7-9周龄，雌雄各半，体重18-22g，由河北医科大学实验动物中心提供，合格证编号：704113。动物在实验前适应性驯养1周。饲料和垫料由河北医科大学实验动物中心提供。实验期间自由采食饮水。腹水型S180瘤株由河北医科大学实验动物中心提供，L929细胞株由北京市中医研究所提供。1.1.2 药品 六君子汤主要由人参、白术、茯苓、甘草、陈皮、半夏等药物组成，由河北大学附属医院中药房提供，所有药品均经中药专家鉴定。取上述中药自来水浸泡1h后，分别加8倍量、6倍量、4倍量的水煎煮3次，时间分别为药液熬开后40min、30min、20min，将三次煎煮的药液混合，离心，

11、取上清，80水浴浓缩至每毫升含生药0.8g，高温消毒后置4冰箱保存备用。注射用环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司(批号：06112021)。1.1.3 主要试剂及仪器 DMSO(Amresco公司产品)，四氮甲唑蓝(MTT，Amresco公司产品)，刀豆蛋白A(ConA，Sigma公司产品)，RPMI-1640完全培养基(Amresco公司产品)，脂多糖（LPS，Sigma公司产品）。酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司产品），CO2培养箱（上海福玛实验设备有限公司产品），超净工作台(苏净集团，苏州安泰空气技术有限公司产品)，倒置显微镜（南京江南永新光学有限公司产品）。1.2 方法1.2.1 动

12、物模型的建立2无菌条件下抽取传代第7日S180小鼠的腹水，按1:3比例用生理盐水稀释，反复冲打、充分混匀，在显微镜下计数，用生理盐水调整细胞浓度为1.5107ml-1，取0.2ml于每鼠右侧腋窝下碘酊消毒后皮下接种。瘤株接种前，均用0.2%台盼蓝染色，计算活细胞数为95%-98%。从抽取腹水时开始，到移植完最后一只小鼠的总时间控制在60min内。1.2.2 分组及给药 小鼠接种24小时后按体质量和性别随机分成荷瘤对照组、CTX组、六君子汤+CTX组和六君子汤组3，另取10只未荷瘤小鼠作正常对照组。正常对照组和荷瘤对照组均用生理盐水灌胃，同时腹腔注射生理盐水，单纯化疗组腹腔注射CTX 0.02g

13、kg-1d-1天，同时用生理盐水灌胃，六君子汤+CTX组腹腔注射CTX 0.02gkg-1d-1，同时用六君子汤8gkg-1d-1（按生药量计算，剂量由预实验得出）灌胃，六君子汤组用六君子汤灌胃，同时腹腔注射生理盐水，各组灌胃容积均为0.4m1/只，腹腔注射容积均为0.2m1/只，各组于瘤细胞接种第2d开始用药，每日1次，连续10d。1.2.3腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定4小鼠脱臼处死，75%酒精中浸泡2min，置超净台。每只小鼠腹腔注射冷PBS液10ml，轻揉腹部2min，回抽腹腔液，离心弃上清。RPM11640培养液洗两次，计数并调节细胞浓度为2106个/ml，加入96孔培养板，每孔100u

14、l，每样本均设3个复孔。37、5%CO2培养箱培养4小时，温PBS液洗并吸出未贴壁细胞，得到巨噬细胞单层。于每孔中加入0.03%的中性红溶液1OOul，置CO2培养箱培养1小时，用温PBS液反复冲洗未被吞噬的中性红3次。于每孔中加入细胞裂解液（1:1的冰醋酸和无水乙醇)1OOul，4静置过夜，用酶标仪在570nm处测定OD值。1.2.4 NK细胞活性测定5无菌摘取脾脏，按常规制备脾细胞悬液，用含10%小牛血清的RPMI1640培养液配成1107/ml浓度作为效应细胞。取传代培养的L929细胞，用0.25%胰酶消化液消化2min，加入完全RPMI1640培养液，调细胞浓度为2105/ml作为靶细

15、胞，在96孔平底板上每孔加入靶细胞悬液1OOul，37、5%CO2培养90min，使其贴壁成单层细胞，然后实验孔加入1OOul效应细胞悬液，做4个复孔，靶细胞对照孔加完全RPMI1640培养液1OOul；然后将96孔板放在37，5%CO2孵箱中孵育20h，去上清，用生理盐水轻轻注满各孔，反复3次，以除去效应细胞和被杀伤脱落的靶细胞，在滤纸上吸干孔内水分；每孔加入0.1%的中性红染液1OOul，孵育30min，弃去染液，用生理盐水洗3遍，每孔加1OOul细胞裂解液，使含有中性红的靶细胞溶解，摇匀，用酶标仪在450nm测OD值，用以下公式计算杀伤率。杀伤率(%)=(靶细胞OD值-实验组OD值)/靶

16、细胞OD值100%1.2.5 T淋巴细胞增殖能力的测定6 无菌摘取脾脏，常规制作脾细胞悬液，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞，调细胞浓度至5106L，加入96孔细胞培养板100ul/孔，再分别加入ConA 100ul/孔使其终浓度为6ug/ml，将上述加好的培养板置37、5%CO2培养箱68h，取出，每孔吸出10ul，加0.5 g/L MTT 10l/孔，置培养箱内4h，取出，加10%SDS-HCL溶液100ul/孔，振荡过夜，酶标仪测570nm波长的吸光度(OD)值。以各样本A值代表其T淋巴细胞增殖能力。1.2.6 B淋巴细胞增殖能力的测定无菌条件下常规取脾制备脾细胞悬液

17、，用 RPMI-1640完全培养液调细胞浓度至 5106/ml加入 96 孔培养板，加入LPS100ul/孔使其终浓度为10ug/ml，其余步骤同1.2.5。1.3 统计学处理各组数据以均数标准差（s）表示，用SPSS 14.0进行方差分析。2 结果2.1六君子汤对化疗荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 由表1可知，CTX组与各组相比，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能降低(P0.01)；CTX联合六君子汤治疗后，小鼠巨噬细胞吞噬功能升高，差异显著(P0.05)。表1六君子汤对化疗荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能和NK杀伤率的影响（s；n =10）组别剂量（g/kg）巨噬细胞吞噬功能（OD）NK杀伤率（）六君子

18、汤 CTX正常对照组 0 01.3140.193b15.923.12b荷瘤对照组 0 01.1000.122b10.781.94bCTX组 0 0.020.8340.1624.360.86六君子汤+CTX组 8 0.021.0220.183a10.322.24b六君子汤组 8 01.2790.188b15.333.07b注：与CTX组比较aP0.05，bP0.012.2六君子汤对化疗荷瘤小鼠NK细胞杀伤率的影响荷瘤小鼠用CTX化疗后，NK细胞杀伤率显著降低，统计学差异显著(P0.01)；而联合六君子汤治疗后NK细胞杀伤率明显升高，差异显著(P0.01)，见表1。2.3六君子汤对化疗荷瘤小鼠脾淋

19、巴细胞增殖的影响如表2所示，荷瘤小鼠用CTX化疗后，T、B淋巴细胞增殖显著降低，统计学差异显著(P0.01)；而六君子汤与CTX联合用药，能够对抗CTX所致的淋巴细胞增殖抑制，与CTX组比较差异显著(P0.01)。表2六君子汤对化疗荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的影响（s；n =10）组别剂量（g/kg）T淋巴细胞增殖（OD）B淋巴细胞增殖六君子汤 CTX正常对照组 0 00.3840.033b0.2500.021b荷瘤对照组 0 00.3090.0210.2030.015CTX组 0 0.020.2780.0160.1960.011六君子汤+CTX组 8 0.020.3470.021b0.2290.

20、011b六君子汤组 8 00.3760.016b0.2390.013b注：与CTX组比较bP0.013 讨论人类许多疾病都与机体免疫功能低下有密切的关系。大量研究资料表明，肿瘤患者免疫功能低下，而且有些患者必须采取化疗进行辅助治疗，常用化疗药大多为免疫抑制剂，且有一定副作用，这就进一步降低了机体的免疫力。近年来，临床上已开始采用免疫辅助疗法用于肿瘤治疗，尤其是中药的应用对于提高机体免疫力、维持机体免疫功能的相对稳定、改善恶变、化疗及放疗引起的免疫功能低下均有一定疗效。T、B淋巴细胞是机体的免疫活性细胞，其激活、分化、增殖在免疫应答过程中起着重要的作用。T淋巴细胞主要发挥细胞免疫功能，并协助B淋

21、巴细胞产生抗体而参与体液免疫，还可产生淋巴因子起免疫调节作用，在抗肿瘤、免疫监视等方面起重要作用。T淋巴细胞在特异性抗原或非特异性抗原ConA等作用下，会发生转化、增殖，T淋巴细胞增殖反应率是一个能够代表机体免疫能力的重要指标7。NK细胞是细胞免疫中的非特异性成分，是机体的重要免疫监视细胞，在机体第一线防御机制中行使主要功能，不经致敏即可直接杀伤多种肿瘤细胞和带病毒细胞，还参与机体对免疫反应的调节8。本研究发现，荷瘤小鼠用CTX治疗后，NK细胞杀伤率、腹腔巨噬细胞吞噬功能和T、B淋巴细胞增殖能力均显著降低，说明CTX可抑制荷瘤小鼠的免疫功能。而用六君子汤联合CTX治疗后，荷瘤小鼠以上免疫学指标

22、的数值均有所增加，与CTX组比较差异显著。提示六君子汤可对抗CTX引起的免疫抑制。目前肿瘤的治疗还是一个难题，多数抗肿瘤药毒副作用明显，尤其是对免疫功能的抑制，如药物既杀伤肿瘤细胞，又阻止机体免疫力下降或激活机体免疫功能，就可大大提高肿瘤治疗疗效。在世界范围内，抗癌药物的研究已逐渐转向天然动植物，我国传统的中医药以其疗效明显副作用小，越来越受到人们的青睐。但多数研究为中药单药有效成分提纯物，符合传统用药习惯的复方抗肿瘤作用研究较少，而经典古方的研究鲜有报道。六君子汤是常用的补益剂，临床运用广泛，但其基础研究较少，尤其在对抗化疗药所致的免疫功能低下方面的研究少有报道，本研究表明，经典名方六君子汤可提高化疗荷瘤小鼠NK细胞杀伤率、腹腔巨噬细胞吞噬功能和T、B淋巴细胞增殖能力，对小鼠免疫功能具有增强的作用，提示六君子汤对化疗所引