分子生物学常用技术.ppt课件

1、分子生物学常用技术 第十七章分子生物学常用技术 凝胶电泳 分子杂交 聚合酶链反应(PCR)技术 DNA的物理图谱 DNA序列测定 基因芯片第一节 凝胶电泳(gel electrophoresis)电泳概念基本原理 Q 6r : 迁移率 Q : 电荷量 r : 粒子半径（分子量） : 介质粘度 电泳的用途分离鉴定纯度测定分子量凝胶电泳的种类琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis) 分离核酸原理 操作要点 应用范围（一）分离核酸原理 电荷效应 分子筛效应 分子构象1. 电荷效应 核酸是两性电解质 pH = 3.5 , 正电荷

2、pH = 8.08.3 , 负电荷，正极2.分子筛效应 小分子移动快 ，大分子移动慢3. 分子构象闭环超螺旋线状DNA开环DNA +-（二）操作要点支持物 凝胶浓度的选择 DNA分子量标准 电泳缓冲液 样品制备 电泳条件 DNA电泳染色 DNA片段的回收 1. 支持物商品化的琼脂糖琼脂糖种类普通低熔点高纯高筛分熔点8090几十V/cm温度：1525 潜水电泳7.电泳染色 溴乙锭(ethidium bromide, EB) 结构及染色原理 染色方法加入凝胶液中 电泳结束后染色 EB染色原理紫外灯下显色8. DNA片段的回收低熔点琼脂糖法 透析袋电洗脱法(5kb) DEAE-纤维素膜法(0.55k

3、b)（三）应用范围 DNA的分离、纯化和鉴定 限制性酶切图谱分析 重组体的分离、鉴定 杂交分析 PCR产物的分离鉴定 琼脂糖凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 分离原理 操作要点 优点 应用范围（一）分离原理 电荷效应 分子筛效应PAGE支持物单体丙烯酰胺(Acr) 交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis) 催化剂过硫酸胺(AP) 加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)聚丙烯酰胺凝胶（二）操作要点凝胶的分类 凝胶浓度的选择 凝胶液的配制 凝胶中DNA的检测DNA片段的回收 1. 凝胶的分类非变性凝胶：dsDNA变性

4、凝胶: ssDNA尿素甲酰胺SDS2. 凝胶浓度的选择3. 凝胶液的配制 试剂(ml)制备浓度(%) 3.5 5.08.0122030%Acr11.616.626.640.066.6ddH2O67.762.752.739.312.75XTBE20.020.020.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100mlPAGE装置电 泳4. 凝胶中DNA的检测溴乙锭染色法 银盐染色法 甲醛 还原放射自显影法 Ag+DNA Ag（黑褐色） 5.DNA片段的回收压碎浸泡法 1kb 纯度高，回收率低（三）PAGE优点机械强度好、化学稳定性高分辨率高 载样量大 回收的D

5、NA纯度高 （四）PAGE应用范围分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNA DNA序列分析 PCR产物鉴定 蛋白质的检测和分析 第二节 分子杂交分子杂交的基本原理固相支持物探针几种常用杂交技术一、分子杂交的基本原理 核酸的变性和复性分子杂交DNA-DNADNA-RNA杂交条件 靶分子 探针 杂交袋 杂交炉杂交种类被检核酸种类和方法 原位杂交斑点杂交Southern杂交Northern杂交Western杂交 反应介质 液相杂交 固相杂交()二、固相支持物 固相支持物的特性结合能力强不影响杂交反应结合牢固 非特异性吸附少 机械性能良好 固相支持物的种类 硝酸纤维素滤膜 (nitrocellulose

6、filter membrane) 尼龙膜(nylon membrane)1.硝酸纤维素滤膜 特点吸附ssDNA和RNA 杂交信号本底低 不足不适于重复杂交滤膜较脆 不适于电转移印迹法 对DNA小片段(缺口翻译 操作简便 DNA/cDNA 探针 DNA的5末端标记(5end labeling) 碱性磷酸酶T4多核苷酸激酶 标记原理 制备寡核苷酸探针 制备短的DNA/RNA探针 DNA的5末端标记四、Southern 杂交Southern blotting/DNA blotting1975年，Edwen Southern等印迹(blotting) : 转移 blot: a spot or mark

7、, esp. of ink blotting 1. 印迹的方法 毛细管转移法 电转移法 真空转移法 毛细管转移法 电转移法真空转移法2. Southern 杂交的步骤3. Southern 杂交的应用基因的定性及定量分析基因的酶切图谱分析基因突变分析 RFLP五、Northern 杂交 RNA blotting 步骤 总RNA/mRNA变性电泳分离转移杂交放射自显影/化学显色 应用检测组织/细胞中mRNA的大小、量 比较不同组织/细胞中基因的表达情况 Northern 杂交六、Western 杂交免疫印迹(immunoblotting) SDS转移蛋白第一抗体标记的第二抗体(探针)检测 应用蛋

8、白质的定性定量分析免疫印迹 Southern,Northern & Western待测物质 支持物 探针 转移方式Southern DNANC 单链核酸 毛细管/电/真空 Northern RNANC/尼龙 单链核酸 毛细管/电/真空 Western 蛋白质NC/PVDF 抗体电转移 七、原位杂交(in situ hybridization)定义种类细胞内原位杂交组织切片原位杂交 基本程序 细胞/组织固定预杂交杂交冲洗 杂交信号检测 分析结果 组织切片八、斑点杂交(dot hybridization)第三节 PCR技术 聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PC

9、R)PCR的发展简史PCR的基本原理和步骤PCR的影响因素PCR的种类PCR的应用一、PCR的发展简史 1971年,Korana提出核酸体外扩增的设想 1985年, Mullis 等发明了PCR技术 1988年, PE-Cetus公司推出了第一台PCR仪 二、PCR的基本原理和步骤基本原理DNA复制 三个步骤变性(denaturation) 退火(annealing) 延伸(extension) PCR的原理PCR的扩增产物cycle 12345n长片段 246810短片段 002822长短 21222324252n标准的PCR反应体系 10X 扩增缓冲液： 10ul 模板DNA: 0.12u

10、g 引物： 各0.21umol/L 4种dNTP: 各200umol/L Mg2+: 1.5mmol/L Taq DNA聚合酶： 2.5U 总体积： 100ul三、PCR的影响因素 模板 引物 Taq DNA聚合酶 4种dNTP Mg2+ 循环条件 模板 DNA RNAcDNA 对模板的纯度要求低引物长度：1530nt G+C含量：4060% 碱基的随机分布 避免引物自身和引物之间的互补 引物的3端 引物的5端 引物浓度：0.21umol/L Taq DNA聚合酶 2.5U/100ul 20保存 最后加 底物 4种dNTP 的浓度相等终浓度：200umol/L Mg2+ 浓度: 1.52.0m

11、mol/L 过高: 非特异扩增 过低 : 反应产物减少 循环条件变性温度和时间: 9096, 3060s 退火温度和时间: 4060, 3060sTm=4(G+C)+2(A+T) 延伸温度和时间7075 (72 )1kb, 1min; 34kb , 34min; 10kb,15min循环次数: 2535 四、PCR的种类反转录PCR原位PCR(in situ PCR)实时PCR(real time PCR)重组PCR(recombinant PCR)锚定PCR(anchored PCR)反向PCR(inverse PCR)原位PCR原位杂交PCR程序 固定细胞/组织样品PCR前处理PCR扩增原

12、位杂交及检测 实时PCR的原理五、PCR的应用分子生物学研究临床医学分子生物学研究基因克隆 DNA序列测定基因的体外定点突变 突变分析(PCR-SSCP) 基因定量 临床医学病原体诊断 遗传病的基因诊断 肿瘤检测 法医学 第四节 DNA序列测定 Sanger 双脱氧链终止法(1977) Maxam-Gilbert化学裂解法(1977) Sanger 双脱氧链终止法 原理DNA复制 反应条件 模板引物 dNTP（其中一种带放射性标记） ddNTP DNA聚合酶DNA的复制2,3-双脱氧核苷酸(ddNTP)DNA测序操作DNA自动测序 DNA自动测序仪第六节 生物芯片(Biochip) 20世纪9

13、0年代末生物分子之间相互作用的特异性种类 细胞芯片、组织芯片、微生物芯片、基因芯片、蛋白质芯片 基因芯片 概念 种类 应用领域 表达谱基因芯片及其检测原理 应用举例什么是基因芯片？ 基因芯片(Gene chip, DNA chip),又称为DNA微阵列(DNA Microarray)，是指固定在载体上的高密度DNA微点阵。具体地说就是将大量寡核苷酸或cDNA有序地、高密度地排列在玻璃、硅等固相载体上。基因芯片芯片的制备基因芯片的种类表达谱基因芯片 诊断芯片 检测芯片 基因芯片的应用领域基因芯片基因表达谱疾病诊断药物筛选新基因寻找 测序基因分型基因突变表达谱基因芯片及其检测原理研究在不同组织或细

14、胞、不同发育阶段中基因的表达差异，进而阐明基因的功能 检测原理表达谱基因芯片应用举例用基因表达谱芯片研究人正常和肝细胞癌中差异表达的基因 肿瘤的分型及预测 1999年，Gulop等 急性白血病的分型 AML(13/10) ALL(25/24)9、春去春又回，新桃换旧符。在那桃花盛开的地方，在这醉人芬芳的季节，愿你生活像春天一样阳光，心情像桃花一样美丽，日子像桃子一样甜蜜。2022/7/242022/7/24Sunday, July 24, 202210、人的志向通常和他们的能力成正比例。2022/7/242022/7/242022/7/247/24/2022 7:41:32 AM11、夫学须志

15、也，才须学也，非学无以广才，非志无以成学。2022/7/242022/7/242022/7/24Jul-2224-Jul-2212、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。2022/7/242022/7/242022/7/24Sunday, July 24, 202213、志不立，天下无可成之事。2022/7/242022/7/242022/7/242022/7/247/24/202214、Thank you very much for taking me with you on that splendid outing to London. It was the first time that I had seen the Tower or any of the other famous sights. If Id gone alone, I couldnt have seen nearly as much, because I wouldnt have known my way ab