一般毒性作用课件2

1、第六章一般毒性作用General toxic effects 一. 概述 二. 急性毒性作用 三. 局部毒性作用 四. 短期、亚慢性和慢性毒性作用 （蓄积性与耐受性） 一般毒性： 1. 急性毒性 （acute toxicity） 2. 局部毒性 （local toxicity） 3. 亚急性毒性 （subacute toxicity） 4. 亚慢性毒性 （subchronic toxicity） 5. 慢性毒性 （chronic toxicity）重复暴露毒性 特殊毒性： 1.致癌 （carcinogenicity） 2.致突变 （mutation） 如：小鼠微核试验（mouse micron

2、ucleus test） 小鼠显性致死试验（mouse dominant lethal test） 大鼠染色体畸变试验（rat chromosome aberration test） 3.致畸 （teratogenesis） 4.生殖发育毒性 （reproductive and developmental toxicity） 5. 药物依赖性 （drug dependence)一、一般毒性作用概念和意义 一般毒性评价主要目的： 1. 确定受试物毒作用表现与性质； 2. 确定受试物毒作用的剂量与反应关系； 获得的参数有：LD50、LOAEL、NOAEL 3. 确定毒作用靶器官； 4. 评价毒性损

3、害的可逆性； 5. 了解化学药物毒作用的影响因素等。第一节 概 述二、一般毒性试验的动物选择 （一）实验动物选择 1.物种 选择原则： 与人体生物学特征相似的动物； 自然寿命不太长的动物； 易于饲养与实验操作的动物； 经济并易于获得的动物。 （一般选择两个物种进行试验） 2.品系 一般在毒理学系列研究中应使用同一品系。 3.级别（质量） 级（清洁级）或级（SPF级）的动物 4.性别 受试物毒性如果有性别差异，应选择敏感的性别，若没有应选择两种性别进行试验（/各半）。 5.年龄与体重 急性试验-选择成年动物；慢性试验-刚断乳动物。同一性别动物的起始体重差异平均体重20%。 6.生理与健康状况 不

4、选择怀孕、哺乳其动物，须选择健康动物（健康观察期5-7天）。（二）染毒方式 选择原则： 一般选择受试物实际与人接触的途径。 1.呼吸道染毒 有：气管注入染毒 吸入染毒（静式与动式两种） 2.消化道染毒 有：灌胃法、喂饲法和胶囊法。 3.经皮染毒 有：表皮涂药、浸尾法。 4.注射途径 有：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内等。 一、急性毒性概念 是指1次接触或24小时内多次接触外源化学物在短期内所产生的健康损害作用和致死效应。 实验效应观察期：2周。 24小时多次染毒： 毒性很低或溶解度很低的受试物。 一般规定：3次/24小时，每次间隔4小时以上。第二节 急性毒性作用二、急性毒性试验的目的 1.评价急

5、性毒性大小 求出LD50、LD100、LD01、LD0或MTD、LOAEL、NOAEL等。 2.了解急性毒性特征（中毒症状与体征） 3.为亚急性、亚慢性、慢性、致癌等试验提供剂量设置的依据。 4.为毒作用机制研究提供初步线索。用LD50作为剂量参考依据的毒性试验 试验类别 剂量设组要求 蓄积毒性试验 1/20-1/5 LD50范围设组 亚慢性试验 1/20-1/5 LD50作最高剂量 慢性(致癌)试验 1/10 LD50作最高剂量三、急性毒性试验方法要点 （一）经典急性毒性试验 （即传统LD50法） 基本要求:（OECD） 1.检疫观察3-5d，成年健康动物（大鼠首选）； 2.5-7个剂量组，

6、每组10只动物以上（/各半）； 3.剂量组距合适，一般为等比级数； 4.给药途径尽量与实际接触一致； （隔夜禁食（12-14h），给药后再禁食3-4小时） 5.毒性观察期至少2周以上，每天观察1次。LD50计算方法： 曲线拟合法 （概率单位法或Bliss法） 插值法 累积法 寇氏法 移动平均法 霍恩(Horn)法-查表法 Weil查表法等剂量设置依据： 参考同系物或类似物的急性毒性资料； 最大耐受致死量（LD0）测定； WHO规定给药剂量：经口 5000mg/kg 经呼吸道 5000ppm 经皮肤 2000mg/kg 预试验测定致死剂量范围 即死亡率从0%100%（10%90%) -Lork法

7、（改良法的组距为1.3-1.5） -组距法改良Lork简化剂量设计方案公式： i =（lgLD90-lgLD10）/（n-1） 或 i=（lgLD100-lgLD0）/（n-1） 式中：i-为组距 n-为设计的剂量组数组距法确定各组剂量 假定某化学药物LD100为2000mg/kg, LD0为500mg/kg,设6个剂量组，各染毒组的剂量是多少？ 1.按公式求出对数剂量组距（I） 公式： I=（lgLD100-lgLD0）/（n-1) =（lg2000-lg500）/(6-1) =（3.301-2.699）/5 =0.120 2.确定各组实际剂量（见下表） 实例某化学药物急性毒性试验剂量设置

8、组别 剂量对数 剂量（mg/kg） 1 2.701 502.3 2 2.821 662.2 3 2.941 873.0 4 3.061 1150.8 5 3.181 1517.1 6 3.301 2000.0 注：剂量对数组距=0.12，剂量组间的等比级数=1.318 要求： 56个剂量组，每组动物数相等； 死亡率呈正态分布； 最低剂量组死亡率20%； 最高剂量组死亡率80%， 各组剂量呈等比级数（一般为1.2-1.5）。特点： 计算结果简便（按公式计算） 精确度高1.改良寇氏 (Karber)法 点斜法LD50(或LC50)计算 公式： lgLD50Xki(p0.5) pq Si n LD5

9、0的95%可信限(LD501.96 S) LD50计算公式：式中： m-lgLD50; i-组间对数剂量差值； Xk-最大剂量的对数值； q-存活率（q=1-p）； p-各剂量组死亡率总和； n-每组动物数。 应用实例公式：lgLD50 =1.4961-0.08(2.3-0.5) =1.3521 lgLD50及其95%可信限为1.35211.960.0213=1.31041.3938 LD50及其95%可信限为22.5 mg/kg（20.4424.76 mg/kg） 要求： 4个剂量组，每组动物数相等（4只或5只） 雌雄分开试验 每组剂量为固定倍数递增（2.15倍，3.16倍） 特点： 动物用

10、量少 结果查表可得（查表可得LD50及95%可信限范围） 精确度不高2.霍恩(Horn)法 又称剂量递增法 霍恩(Horn)法查表-2.15倍组距例如：全活-全死剂量范围为200-1500mg/kg 剂量组选择215,464,1000,2150 (t=2) 霍恩(Horn)法查表-3.16倍组距例如：全活-全死剂量范围为180-3500mg/kg 剂量组选择100,316,1000,3160 (t=2)(二）急性毒性替代法 “3R”原则要求： 替代（Replacement） 减少（Reduction） 优化（Refinement） 常见的替代法有： 1.限量试验（limit test） 2.固

11、定计量法（fixed dose method） 3.急性毒性分级法（acute toxic class method） 4.上下法（up and down procedure）-序贯法 使用条件： 受试物急性毒性很低时可采用此法。方法要求： 受试动物一般为啮齿类动物； 24小时内多次给予受试物； 20只动物，雌雄各半； 给予最大剂量，一般为10000mg/kg； 毒性观察期14天；毒性评价： LD50给药剂量（mg/kg） 1.限量试验 方法要求：（实际上是一种非死亡毒性评价） 固定剂量：5、50、300、2000mg/kg； 预试验：用单性别1只动物循序进行，接受试验前后的2只动物间隔24小

12、时。如一个剂量无中毒表现，其上个剂量动物死亡，需在中间插入剂量进行试验； 正式试验：根据预结果，取5只动物进行试验； 限量试验：如果2000mg/kg预试验和正式试验均不出现中毒表现，试验终止，为未观察到毒性(U) 。 若正式试验5mg/kg出现中毒表现或死亡，试验终止，可定为高度(T+)。 结果判断（OECD）： 高毒(T+)、有毒(T)、有害(H)、未观察到毒性(U)。2.固定剂量法FD法急性毒性分级选定： 3.急性毒性分级法注：按全球化学品分类及标签协调制度（GHS）标准评价定级 要求： 先以一个剂量进行一个动物试验，如动物死亡，则以下一个较小剂量试探，若仍动物死亡则以下一个更小剂量试探

13、；如动物存活，则以较大剂量试探，依次类推，最终按公式计算LD50值。 死亡观察为48小时，存活动物观察14天。特点： 节省动物（一般6-10只动物或以上）； 适用于毒性反应快速的化学药物。4.序贯法（ - 又称上-下法）序贯法实验计算公式：式中： n-使用动物总数； x-每个剂量组的剂量； f-每个剂量组动物数。应用实例 （三）急性毒作用观察 观察记录内容： 中毒症状（观察2周，记录症状发生的时间、程度和持续时间等）； 试验前后记录体重（每周至少称体重1次）； 死亡记录（死亡数用于计算LD50）； 大体解剖与病理学检查等。 四、急性毒性分级WHO急性毒性分级标准： 国内健康相关产品毒性分级 G

14、HS化学品急性毒性分级标准（2002） 第4级上限值注：GHS-全球化学品分类及标签协调制度 （Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals ） LD50评价问题 1.毒性大小比较 LD50值较大者的95%可信限的下限LD50值较小者的95%可信限的上限。前者的毒性小于后者。 如果可信区间存在重叠，按公式进行t检验： 公式： 2.剂量-反应曲线斜率比较 （可分析毒性特征） 3. LD50值表示 表示LD50时应注意标明： 动物品系； 染毒途径； 95%可信限范围。 LD50 1.96 S 例如：异氰

15、酸甲酯 大鼠经口 LD50值为69mg/kg5.6 即63.474.6mg/kg。 概念： 局部毒性作用又称局部损害作用，是指生物机体暴露于化学物后，在其接触或暴露部位造成的局部毒性损害作用，包括腐蚀性、刺激性与过敏性作用。 目的： 1.评价化学物对眼睛、皮肤的刺激与腐蚀作用和皮肤的致敏作用及其程度或等级； 2.为制定化学物安全使用规范提供科学依据。第三节 局部毒性作用一、眼睛刺激试验 眼刺激性（eye irritation）指眼球表面接触受试物后所产生的可逆性炎性变化。 眼腐蚀性（eye corrosion）指眼球表面接触受试物后引起的不可逆性组织损伤 。 试验方法：Draize 法（194

16、4年） 常用动物：白兔Draize 法： （自身对照原则） 试验方法：一般采用4只白兔，受试物以一次剂量滴入每只实验动物的一侧眼结膜囊内（0.1ml），以生理盐水处理另一侧眼作为自身对照。在规定的时间内观察对兔眼的刺激和腐蚀作用程度，并按规定的分级标准进行评分。 观察指标：结膜(发红、球结膜水肿和分泌物)，角膜(混浊程度和范围)，虹膜(充血、肿胀和角膜周围充血)。 实验期限：一般为7天，必要时延长至21天(观察期能足已评价刺激是否存在可逆性)。 注意事项： 如72h眼刺激反应仍不消退时，需另取4只白兔观察洗眼效果，即滴入受试物后分别在4s和30s时，用生理盐水洗眼5min，观察洗眼后的眼睛反应

17、。（洗眼效果试验）Draize 法眼损伤程度评分表：（续表）眼睛刺激动物试验替代法： 1.受精鸡卵尿囊绒膜试验 利用尿囊绒膜与结膜结构相似性。 2.细胞膜损伤溶血试验 用分光光度计法测定溶血程度（Hb从RBC漏出）。 3.血红蛋白变性试验（用酶标仪测定） 因角膜透明度降低是化学物破坏了蛋白质构象。 4.细胞毒性试验 兔眼角膜上皮细胞SIRC模型，观察细胞增殖、膜完整性等（中性红不能沉积在死细胞内，用酶标仪测定） 5.生物膜替代法等方法 受试物+立体人类皮肤+MTT，用酶标仪测定提取液中的MTT吸光度（MTT不能沉积在死细胞内）二、皮肤刺激试验 皮肤刺激性（dermal irritation）指

18、皮肤接触或涂敷受试物后，局部产生的可逆性炎性变化。 皮肤腐蚀性(dermal corrosion）指皮肤接触或涂敷受试物后，引起局部的不可逆性组织损伤 。 皮肤刺激试验类型： 单次和多次皮肤刺激试验； 完整皮肤和破损皮肤刺激试验等。 试验方法：Draize 法（1944年） 常用动物：家兔或豚鼠 破损皮肤刺激试验 是人为将动物皮肤某部位擦伤（不能伤及真皮和产生出血），以比较受试物对完整皮肤及受损皮肤造成的刺激反应的差异。 伤口消毒药物一般都需要做破损皮肤刺激试验。皮肤刺激试验（Draize 法）： （自身对照原则） 试验方法： 将受试物一次或多次涂敷于受试动物背部一侧皮肤上(0.5ml)，涂敷

19、持续时间一般为4h，以生理盐水处理另一侧背部皮肤作自身对照。 观察指标： 皮肤反应常为红斑或紫红色斑、水肿等，损伤严重时可形成焦痂，一般按红斑和水肿的严重程度评分，并与自身对照比较，从而评价受试物对皮肤的刺激作用。 实验观察期：一般为14天。皮肤刺激试验结果的影响因素： 1.皮肤的完整性（皮肤受损程度）； 2.固态受试物的物理状态与溶解度； 3.受试动物年龄与性别； 4.实验人员主观因素（存在判断差异）等。无需做皮肤刺激试验条件： 受试物为强酸或强碱类腐蚀性物质（pH2或11.5） 受试物有很强的经皮吸收毒性，经皮LD50小于200 mg/kg体重； 急性经皮毒性试验中，受试物剂量达2000m

20、g/kg体重仍未出现皮肤刺激性作用。 皮肤刺激/腐蚀的体外替代法： 1.单层皮肤细胞培养模型 单层细胞培养技术 （如：皮肤角质形成细胞、皮肤黑色素细胞、皮肤成纤维细胞等） 2.表皮组织培养模型 EpidermTM重组人表皮模型（美国） 3.器官型人工皮肤模型 即体外构建的含表皮和真皮双层结构Draize 法皮肤损伤程度评分表：三、皮肤变态反应试验 皮肤变态反应（skin sensitization） 是皮肤对化学物产生的免疫源性皮肤反应，又称过敏性接触性皮炎或皮肤致敏反应。 在人身上有瘙痒、红斑、丘疹、水疱、融合水疱等，在实验动物身上，通常只能见到皮肤红斑和水肿等反应。 试验目的：确定重复接触

21、化学物是否可引起变态反应及其反应程度。 受试动物：豚鼠，每组动物1020只。 实验设计：需做阳性对照和阴性对照，阴性对照动物仅给予受试物激发接触。（阳性物-2,4-二硝基氯苯） 致敏机制： 化学物在穿透皮肤的过程中，可作为半抗原与体内某些特定的载体蛋白共价结合，形成完全抗原，诱导抗体形成，产生免疫记忆，如再次接触较低浓度的相同或结构相似的化学物，即能引发皮肤变态反应。 试验方法： 局部封闭涂皮法（Buehler Test）（传统方法） 豚鼠最大值试验（guinea pig maximization test） 用完全福氏佐剂，皮内注射。 局部淋巴结试验（local lymph node ass

22、ay，LLNA） 实验记录： 记录皮肤具有红斑和水肿（过敏反应）的动物数。局部封闭涂皮法（二步法） 致敏接触： 实验前将受试动物背部左侧皮肤去毛区3cm3cm，将受试物0.10.2ml涂在2cm2cm滤纸上，将其敷贴在去毛区，用两层纱布，一层油纸或不透水塑料膜覆盖，再以无刺激胶布固定，持续6h，6h后去除敷贴及受试物。第7天和第14天以同样方法重复一次。 激发接触： 实验前将受试动物背部右侧皮肤去毛区2cm2cm。末次致敏后1428天，将0.10.2ml或低于致敏浓度的受试物斑贴于右侧去毛区，覆盖方法同前，持续6h，去掉斑贴及受试物后，每日观察至第12天。一、概述 重复多次接触化学物的毒性研究

23、。 根据持续时间分类（按OECD）： 短期毒性作用（亚急性） （染毒期一般为28天） 亚慢性毒性作用 （啮齿类动物一般为90天，犬为1年） 慢性毒性作用 （啮齿类动物一般为1年，或终身染毒）第四节 短期、亚慢性和慢性毒性作用短期、亚慢性和慢性毒性试验的主要目的： 1.观察长期接触受试物的毒效应谱、毒作用特征与毒作用靶器官以及中毒表现（包括症状与体征）等； 2.探索受试物的作用机制； 3.观察长期接触受试物所致毒作用的可逆性； 4.评价毒作用的剂量-反应（效应）关系，确定最大无作用剂量（NOAEL）、阈剂量（LOAEL），为制订人类基础的安全限值提供依据； 5.观察不同动物种属的毒性差异，为试验

24、结果外推到人，确定安全系数提供依据。二、研究方法（一）短期重复毒性和亚慢性毒性试验基本要求： 1.实验动物的选择 （1）物种与品系 啮齿类动物（首选大鼠，品系Wister与SD大鼠） 非啮齿类动物（犬，品系Beagle） （2）性别、年龄和动物数 雌雄各半；大鼠年龄一般6周，体重50-100克，每组动物20只。犬用4-6月龄(9个月)，每组动物8只。 （3）动物等级与饲养条件 清洁级及以上等级动物，屏障环境饲养，饲料、饮水、垫料、气温、气湿、压力、光照等符合GLP要求。 2.染毒途径与染毒期限 应尽量与人实际接触相似的途径；染毒频率一般为每日1次，连续给予（每周可给予5-6次） （1）经口染毒

25、 灌胃法-大小鼠 喂饲法-大小鼠（受试物在饲料一般5%） 吞咽胶囊法-犬 （2）呼吸道染毒 每天染毒时间2-6小时（OECD：为持续4小时染毒） （3）注射途径 应注意无菌操作 染毒期限：短期重复暴露-28天；亚慢性暴露-90天3.剂量选择与分组 一般选择至少3个剂量组和1个阴性对照组（溶剂），若要中期观察或实验结束后恢复期观察，对照组与高剂量组需设计“卫星组”。 剂量组设计原则： 高剂量组动物应有明显中毒反应，但不引起死亡； 中剂量组动物出现轻度的中毒反应； (相当于LOAEL水平) 低剂量组动物无毒性反应； （相当于NOAEL水平） 剂量组间距一般为2-4倍。剂量组设计应注意的问题： 以急

26、性毒性试验中同一动物品系和同一染毒途径获得的LD50为依据； 如28天经口毒性试验可按LD50的10-25%作为最高剂量，最低剂量应是人体预期实际摄入量3倍以上。 对于求不出LD50的受试物，即毒性很低的受试物，如药品、食品，可根据人体实际摄入量为依据。 药品：大鼠可用人临床拟用剂量的10、30、100倍，非啮齿类动物可用5、15、50倍的剂量进行剂量设置； 食品：试验剂量应涵盖人体预期摄入量的100倍，在不影响营养摄食与营养平衡情况下，高剂量组可按最大给予量设计。4.观察指标选择 应能观察到受试物的靶器官和敏感毒性指标。 一般观察指标（中毒症状）； 体重、食物消耗量与饮水消耗量； 眼部观察；

27、 血液学指标； 血液生化指标； 尿常规指标； 体温与心电图检查； 病理学检查（大体解剖与组织病理学检查）； 特异性指标（效应标志物）。5.观察时间 如果设计恢复期观察： 28天亚急性毒性试验：卫星观察期14天； 90天亚慢性毒性试验：卫星观察期28天； 观察目的： 毒性可逆性； 毒性持续性； 毒性迟发效应等； 观察要求： 至少每天观察一次，详细记录中毒症状、体征、毒 效应性质、毒性持续时间、死亡等情况。（二）慢性毒性试验试验目的： 评价受试动物大部分生命期间给予受试物所发生慢性毒性效应，阐明其剂量-反应关系和靶器官，确定慢性毒性的NOAEL和LOAEL。 根据“3R”原则，慢性毒性试验与致癌试

28、验合并。 1.实验动物与染毒途径选择（与亚急性与亚慢性相同） 2.染毒剂量与染毒期限 一般选择至少3个剂量组和1个阴性对照组（溶剂），若要中期观察或实验结束后恢复期观察，对照组与高剂量组需设计“卫星组”。剂量组距一般为2-4倍，10倍。染毒期限一般至少12个月。 3.观察指标选择（同亚慢性试验）（三）实验结果评价 （短期、亚慢性与慢性毒性结果）评价要求： 确定受试动物发生毒效应的剂量-反应关系和靶器官，求得NOAEL和LOAEL。 要与正常对照组比较，作统计学处理分析： 1.剂量-效应（反应）关系趋势； 2.实验效应重现性（毒性“三个重现”）； 3.相关指标变化分析； 4.毒性的性别差异； 5

29、.持续效应趋势分析； 6.效应差异大小； 7.实验室的历史对照分析（有助于排除假阳性）毒理学研究的实际意义： 如食品安全性毒理学评价中90天喂养试验： 1.最大无作用剂量(NOAEL)人可能实际摄入量100倍，表示毒性较强，应放弃该化学物用于食品； 2.最大无作用剂量(NOAEL)在人可能实际摄入量100-300倍时，应进行慢性试验； 3.最大无作用剂量(NOAEL)人可能实际摄入量300倍时，不必进行慢性试验，即可进行安全性评价。 又如工业化学物毒物的慢性毒性试验： 1.LOAEL与NOAEL值越小，慢性中毒的危险性越大，制定安全限值（卫生标准）应越严格（即安全系数要大）。 2.慢性吸入中毒

30、危险指数 （Rchip=20毒物蒸汽饱和浓度/Limch）评价危险性大小： Rchip100 轻微危害 100Rchip1000 中等危害 1000Rchip10000 高度危害 Rchip10000 极高危害 蓄积毒性试验研究意义： 1.求出蓄积系数(K)，判断化学药物蓄积性大小； 2.为其他相关毒性试验的剂量设计提供依据。基本方法： 1.理化检验法 -（物质蓄积，求t1/2）（残留率测定法） 2.生物效应法 -（物质蓄积与功能蓄积） 蓄积系数法（有固定剂量法与递增剂量法） 20天蓄积试验法 蓄积系数法 蓄积系数是指多次染毒所产生的毒效应(ED50(n)或LD50(n)与一次染毒所产生相同毒效应(ED50(1)或LD50(1)的比值。 公式： Kacc=ED50(n)/ED50(1) 或Kacc=LD50(n)/LD50(1) 求出蓄积系数K值。根据K值的大小判断化学物蓄积作用的强弱，K值越小蓄积毒性越大。 1.固定计量法 基本方法： 求出化学物1次染毒的LD50(1)值；