药学分子生物学：第十章 外源基因表达与基因工程药物1

1、第十章外源基因表达与基因工程药物2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿,我国约6000万。治疗糖尿病特效药胰岛素。1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。第一节 概述胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素 EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体基因工程药物基因工程的产物：多彩小鱼转基因小鼠转基因小猪辣椒香蕉蓝色玫瑰黑籽番茄基因表达指基因通过转录和翻译而产生其蛋白产物，或转录后直接产生其RNA产物的过程。外源基因表达利用细胞内相关酶系及其调控

2、系统，将外源基因转录成mRNA，进而翻译成肽链或加工成活性蛋白质的过程。DNA(基因)mRNA 蛋白质(性状)转录翻译基本概念重组DNA技术采用各种酶将各种外源DNA进行体外的切割与拼接构成DNA嵌合体的技术。分子克隆（基因克隆）将作为供体的重组DNA分子置于与其毫无亲缘关系的受体细胞内复制的过程。克隆 “Clone”源于希腊文“Klone”，原意是用“嫩枝”或“插条”繁殖。现在指生物体通过细胞进行的无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群，简称为“无性繁殖”。可根据其研究或操作的对象分为基因克隆、细胞克隆和个体克隆三大类。基因克隆是指在分子(DNA)水平上开展研究工作以获得大量的相同

3、基因及其表达产物；细胞克隆则是在细胞水平上开展研究工作以获得大量相同的细胞；个体克隆则是经过一系列的操作产生一个或多个与亲代完全相同的个体，如克隆羊等。将不同的生物基因（供体）在体外剪切、组合并和载体（质粒、噬菌体、病毒）DNA连接，然后引入原先没有这类基因的微生物或细胞（受体）内进行扩增，使转入的基因在细胞内高效表达，合成编码该基因的蛋白质。基因工程的核心技术是DNA重组技术（DNA recombinant Tech)。基因工程（gene engineering）外源基因表达基本类型根据宿主细胞不同：原核细胞表达系统；真核细胞表达系统。根据表达产物在宿主细胞生成的部位不同：胞内表达、定位表达

4、、分泌表达。根据表达产物的溶解状况不同：可溶性表达、包涵体表达。根据表达产物的结构状况不同：非融合表达；融合表达。1) 重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟。 跨越天然物种屏障，将原核和真核生物、植物和动物，造福人类，在过去人们难以置信的事情，现在已成为现实。基因工程的重大意义（2）利用重组DNA技术可以在体外大量扩增、纯化人们感兴趣的基因，研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域。 正常人类生命活动的分子机制；人类各种疾病发生的分子机理；人类各种疾病如遗传性疾病、肿瘤、肥胖、心血管疾病、传染病等病因的查明、诊断、治疗和预防。药物的研发和生产；疾病模型的建立；人类的营

5、养、健康、长寿和保健（亚健康）（3）医学上应用更为广泛，涉及各领域 本章节的地位：现代科技革命高新技术生物技术（生物工程）基因工程基因克隆第二节 外源基因表达基本过程Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics181、目的基因的获得2、目的基因与表达载体的重组3、重组表达载体导入宿主细胞及其筛选与确认4、目的基因的表达第二节 外源基因表达的基本步骤基因工程的主要步骤1. 从生物有机体的基因组中，分离出带目的基因的DNA片段目的基因的获得。2. 将带目的基因的外源DNA片段，连接到能自我复制的载体分子上，形成重组DNA分子 DNA分子重组。3.

6、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞内导入。4. 筛选获得了重组DNA分子的受体细胞进行克隆分子克隆。5. 克隆基因的表达，产生出人类所需要的物质基因表达。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics20连接含重组子的阳性克隆载体+目的基因转化、筛选和鉴定阳性克隆DNA重组体+受体细胞图3-10 DNA 分子克隆的基本步骤 分、切、接、转、筛Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics21 （一）从基因文库中获取（二）逆转录法（三）人工合成DNA片段（四）直接从染色体DNA中分离目的基因一、目的

7、基因的获取Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics22制备的目的基因或外源性DNA片段必须与合适的载体连接，才能进入受体细胞进行复制和表达。载体大都经过改造，携带有某些选择性标记和克隆位点的遗传信息等。在常用的克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件（DNA序列）即成为表达载体，这些载体不仅可以携带外源基因片段进入宿主细胞，而且还可以使外源基因在宿主细胞中表达。常用的宿主细胞是大肠杆菌。 二、 载体的选择载体（Vector） 载体(vector)是将外源DNA(目的DNA)片断引入宿主细胞进行扩增或表达的运载工具，其化学本质为DNA 。 大多

8、数的DNA片段不具备自我复制能力，为了能够在寄主细胞中进行繁殖，就必须将DNA片段连接到一种具有自我复制能力的DNA分子上，这种DNA 分子就是载体。常用的载体：质粒、噬菌体和病毒载体分类按载体来源分为:质粒噬菌体病毒按载体用途分为:克隆载体表达载体按载体的宿主细胞分为:原核克隆/表达载体真核克隆/表达载体作为载体的条件 能独立复制具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点)具有遗传表型或筛选标记有足够的容量以容纳外源DNA片段。载体DNA中均有一段非必需区，将外源基因插入 该非必需区，而载体本身不受影响。克隆载体以扩增DNA片段为目的，并不需要得到目的基因所编码蛋白质的载体，适用于外源基因的重组、

9、克隆、复制与保存；克隆载体常带有一个松弛型复制子，一个多克隆位点、筛选标记分类：质粒、噬菌体、黏性质粒、M13噬菌体、酵母载体、真核细胞病毒载体1.常用的克隆载体质粒和噬菌体常用于原核细胞为宿主的分子克隆，病毒则使用于真核细胞为宿主的克隆 1. 质粒（plasmid ）是存在于细菌染色体外的、能自主复制的环状双链小分子DNA，适于做小片断基因的载体。大肠杆菌的质粒载体氨苄青霉素抗性基因：ampr；四环素抗性基因：tetr；DNA复制起点：ori 2022/7/24Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics31pUC18、pUC19质粒载体用质

10、粒构建重组DNA分子（二）表达载体能使外源基因在宿主细胞 中转录和表达的功能性载体。itemClick to edit text1.很强启动子，能被宿主RNA聚合酶识别2.很强终止子3.启动子只有在诱导状态时才能启动转录4.起始密码和SD序列处在合适距离5.需复制原点，在载体内插入人工组成的多克隆位点具备条件2. 噬菌体DNA线状双链DNA，适于做大片段基因的载体。噬菌体 组成特点： 双链线状DNA分子， 全长50kb， 含65个基因， 在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。用噬菌体DNA构建重组DNA分子病毒载体 质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满

11、足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。病毒载体 目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40（Simian Virus 40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等。 （二）重组基因操作的工具基因的剪刀限制性核酸内切酶基因的针线DNA 连接酶载体 （如质粒、噬菌体和动植物病毒等） 基因的运输工具一把特殊的剪刀-限制性内切酶

12、的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE) 是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶，简称限制酶或切割酶。 根据酶的功能、大小和反应条件，及切割的特点，可以将限制性内切酶分为三类： 型酶、型酶、 型酶限制性核酸内切酶命名：大肠杆菌：Escherichia coli；EcoR(E：属名；co：种名；R：株；：发现次序)；流感嗜血菌：Haemophilus influenzae; HindIII限制酶（型

13、）特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断回文序列：是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称;限制性内切酶能识别特定的碱基序列限制酶切出的末端粘性末端（sticky end）：两条链上的断裂位置是交错的、但又是围绕着一个轴线对称排列，其结果产生两个互补的单链末端，这种单链末端由于可以互补成双链结构，所以称为粘性末端。平末端（blunt end）: 在识别序列内同一位置上的核苷酸处进行切割，产生的DNA片段不带粘性末端而是没有单链突出的平齐末端。作用特点断开磷酸二酯键EcoR黏性末端黏性末端 作用特点断开磷酸二酯键Sma平末端 平末端限制性内切酶造成粘性末端有利于重组DNA 分子的

14、构建粘性末端连接方式：(1) 单酶切 (2) 双酶切双酶切Eco R切割位点Bg l切割位点+EcoR+ Bg l双酶切Eco R+ Bg l双酶切T4 DNA连接酶15C重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。目 录Bam H切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用 Bam H切割载体DNA用Bam H切割重组体载体自连目的基因自连单酶切定向克隆将目的基因按正确的方向插入载体的方法插入片段及载体两端具有两个相应的能够产生粘性末端的酶进行酶切2. 平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因载体

15、限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶15C重组体载体自连目的基因 自连目 录3. 同聚物加尾连接在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。5335载体DNA5335目的基因限制酶或机械剪切限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 35 5 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶-核酸外切酶末端转移酶+ dATP末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶15C重组体目 录4. 人工接头(linker)连接由平端加上新的

16、酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R目 录同裂酶(异源同工酶)：凡来源不同但识别和切割同样的核苷酸序列的限制性酶。同尾酶：来源、识别顺序、切割方式不同，但所生成的限制性片段是相同的粘性末端“分子缝合针” DNA连接酶1种类 ： Ecoli DNA连接酶 T4 DNA连接酶2作用：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间 的磷酸二酯键。3作用原理：催化磷酸二酯键形成1.E.coli DNA连接酶或T4DNA连接酶恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键2.T4DNA连接酶T4 D

17、NA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶3.连接酶类型总结类型EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别DNA限制酶和连接酶的发现使基因工程从理论走向了实验室3.基因与载体重组及其策略基因重组目的基因与载体分别经DNA限制性内切酶剪切，再通过DNA连接酶，将目的基因与载体以3，5-磷酸二酯酶连接形成重组体体外重组体构建策略引物设计：加内切酶酶切位点同种内切酶酶切载体PCR技术扩增目的基因DNA连接酶Zhejiang Provincial Key Lab of Medi

18、cal Genetics69(一)粘性末端连接目的基因和载体的连接（重组体构建）本法适用于在质粒和目的基因上有相同单或双酶切位点70粘性末端DNA重组体的构建 3 HO-G CTTAA-p 5 5p-AATTC G-OH 3 3HO-G CTTAA-p 5 5p-AATTC G-OH 3 质粒 目的基因 目的基因和载体连接 EcoR EcoR 碱性磷酸酶 3HO-G CTTAA-OH 5 5HO -AATTC G-OH 3 退火 DNA连接酶 3HO-G CTTAA G CTTAA-p 5 5p AATTC G AATTC G-OH 3 712) 平末端连接质粒和目的基因上没有相同的酶切位点质

19、粒产生平末端的内切酶DNA连接酶目的基因产生粘性末端的内切酶产生粘性末端的内切酶核酸酶S1核酸酶S172人工接头本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点。73本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点。通过同聚尾连接74质粒 目的基因 33 3ACGTC G 55G CTGCA 33 GnGGGACGTC G 55G CTGCAGGGGn 33 CnCCC 55 CCCCn 3 末端转移酶 dGTP 末端转移酶 dCTP 混合，退火 1）转化细菌2）体内修复同聚尾连接法构建 DNA重组体G CCCC GGGGACGTC CTGCAGGGG CCCC G Pst 核酸外切酶 目的基因和

20、载体连接GACGT C CTGCA GG ACGTC C TGCAG CCC GGG GGG CCC Pst Pst (一)、连接方式 T4 DNA连接酶既可以连接两个具有粘性末端的DNA片段，也可以连接两个具有平端的DNA片段，但是连接后者所需的酶量往往是连接前者的50倍。影响连接效率的因素 适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般采用载体：插入片段摩尔数为1：2-3的比例。（二）载体及插入片段的浓度比（三）、连接温度和时间 连接反应的一项重要参数是温度。理论上讲连接反应的最佳温度是37，此时连接酶的活性最高。但37时粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此人们找到了一个

21、既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即1216。（一）宿主细胞（host cell）能接纳重组子并实现重组子的外源基因扩增或表达的受体细胞。原核细胞：大肠埃希菌、芽胞杆菌等。属于原核细胞表达系统。真核细胞：酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞。属于真核细胞表达系统。三、重组表达载体导入宿主细胞宿主细胞的特点限制酶缺陷型重组缺陷型蛋白水解酶缺陷易于重组子的导入遗传稳定性好，易培养安全性高功能互补（二）重组DNA分子导入宿主细胞目的基因序列与载体连接后，要导入细胞中才能繁殖扩增，再经过筛选，才能获得重组DNA分子克隆，不同的载体在不同的宿主细胞中繁殖，导入细胞的方法也不相

22、同。重组子导入宿主细胞方法转导（transduction)转化 (transformation)转染 (transfection)感染 (infection)转导（Transduction）指噬菌体颗粒感染宿主细胞，通过特定的途径，将噬菌体核酸注入宿主细胞内的过程，并使噬菌体核酸在宿主细胞内实现复制、转录、翻译或子代噬菌体的繁殖。实质是：被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组。噬菌体的生活史溶菌生长途径 (lysis pathway)溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)噬菌体转导一、转化 (transfor

23、mation) 由于外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化，早在1943年，Avery等就发现有毒肺炎双球菌的DNA与无毒肺炎双球菌共培养后产生有毒性的肺炎双球菌后代的转化现象。指感受态细胞接纳外源DNA分子的过程，并使其在宿主细胞内实现复制、扩增、转录、翻译（统称表达）。DNA进入细胞的效率很低，可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源DNA接触，就能提高转化效率。感受态细胞(competent cell)：细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞。如：细菌感受态制备、重组体转化及筛选细菌感受态细胞的制备： CaCl2 处理法受

24、体细菌0-4 0.1M CaCl2 冰浴15-30min细菌处于感受态42 ，细胞热休克细菌的细胞膜通透性增加重组DNA进入感受态细胞氯化钙转化法： 将氯化钙，RNA(或DNA) 混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的钙颗粒。大肠杆菌经冰冷CaCl2的处理，就成为感受态细菌，当加入重组质粒并突然由4转入42作短时间处理，质粒DNA就能进入细菌；又称为热休克法。LB 0.18M0.1M CaCl20.1M CaCl2H2O细胞膨胀：低渗环境胞膜收缩：低温环境离子扩散： DNA-Ca2热休克： 42 1L LB培养基:转化将细胞悬浮液置于电场中，通过短暂的高压脉冲电场使细胞膜产生瞬时的可逆性微孔，

25、而将重组DNA引入细胞内。 电穿孔仪 电穿孔杯 384 电穿孔板电转化转染(transfection)对于真核生物，转染就是原核生物中转化的同义词。之所以在真核生物中使用转染这个词来代替转化，是因为人们之前已经习惯了用转化这个词表示真核细胞变为恶性细胞。感染（infection） 噬菌体进入宿主细菌，病毒进入宿主细胞中繁殖就是感染（infection）。 用经人工改造的噬菌体活病毒作载体，以其DNA与目的序列重组后，在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体或病毒，就能以感染的方式进入宿主细菌或细胞，使目的序列得以复制繁殖。感染的效率很高，但DNA包装成噬菌体或病毒的操作较

26、麻烦。重组DNA导入哺乳动物细胞（一）显微注射法 是在显微镜直视下，向细胞核内直接注射外源基因，这种方法应是有效的。但一次只能注射一个细胞，工作耗力费时。此法用于生殖细胞时，有效率可达10。直接用于体细胞却很困难。在动物实验中，应用这种方法将目的基因注入生殖细胞，使之表达而传代，这样的动物就称为转基因动物，目前成功使用得较多的是转基因小鼠，它可作为繁殖大量后代的疾病动物模型。 1982年Palmiter等运用此法将人的生长素基因和牛的生长素基因分别注射到小白鼠的受精卵中，得到了体型巨大的“超级小鼠”，引起整个生物学界的轰动。这一方法外源DNA整合率高、容量大，DNA长到50kb仍然有效，实验周

27、期缩短，因而应用较广泛，是制备转基因动物的一种常用方法。（二）DNA-磷酸钙转染法：DNA如以磷酸钙-DNA共沉淀物形式出现时，由于钙离子有促进DNA透过细胞的作用，培养细胞摄取DNA的效率会显著提高。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。不适用于原代细胞（所需的DNA浓度较高）,操作简便但重复性差。（三）DEAE-葡聚糖转染法 带正电的DEAE-葡聚糖复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。DEAE-葡聚

28、糖仅限于瞬时转染。相对简便、重复比磷酸钙好,但对细胞有一定的毒副作用,转染时需除血清且一般只用于BSC-1,CV-1,COS细胞系（四）阳性脂质体转染 脂质体（liposome）法是应用人工脂质体包装外源基因，再与靶细胞融合，或直接注入病灶组织，使之表达。 近年来用阳离子脂质体包裹DNA，形成的脂质体可以通过与细胞膜融合而将DNA导入细胞，方法简单而有效。（五）电穿孔法 电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。 用电穿孔法处理培养的哺乳类细胞也能提高细胞摄取DNA能力，但所用外加电场的强度、电脉

29、冲的长度等条件与处理细菌者都很不相同。（六）病毒感染法 病毒介导基因转移是通过感染方式完成基因转移，即以病毒为载体（vector）,将外源目的基因通过基因重组技术，将其组装于病毒上，让这种重组病毒去感染受体宿主细胞，这种病毒称为病毒运载体（viral vector）。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics104（一）根据载体的性状变化进行筛选 1根据载体的抗药性标志筛选 大多数质粒载体带有抗生素抗性标记的特征（如Ampr 、Tetr等）当带有完整抗性基因的载体转化无抗性细菌后，被转化的阳性菌获得抗生素抗性基因而存活并形成噬菌斑，未转化菌不

30、能存活，但应排除未重组的空载体。五、重组体的筛选和鉴定Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1052根据载体抗药性标志插入失活选择 某些质粒载体如 pBR322质粒中有Ampr和Tetr 抗性基因，在这两个基因中装有几个常用的MCS，如将外源DNA片段插入BamH识别序列时，则此质粒由Tetr变为对四环素敏感（Tets ）。这种重组子导入宿主菌后，宿主菌在含四环素琼脂糖平皿上不能生长而在含氨苄青霉素的平皿上能够生长。在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含有空载体，此筛选方法称为双抗生素对照筛选。五、重组体的筛选和鉴定106Zh

31、ejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics107(插入失活法) 抗药性标记选择Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1093-半乳糖苷酶基因失活筛选某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ基因，该基因含一段编码-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸-肽的DNA片段， IPTG可诱导此片段合成，此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内-互补，形成完整的-半乳糖苷酶。催化指示剂底物X-gal 形成蓝色菌落。当外源基因插入lacZ基因中MCS，lac -肽基因阅读框架被破坏，细菌内将

32、无-半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，这是常用的蓝白斑筛选实验。 五、重组体的筛选和鉴定 互补利用互补原理筛选重组体pUC18 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics112Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1134营养标记选择 当细胞生物合成途径中某个酶的编码基因失活后，该细胞成为营养缺陷型，如导入细胞的重组DNA能弥补缺陷的基因，那么，培养基中就不需补充有关的营养成分，由此可挑选出含重组DNA的阳性细菌。 五、重组体的筛选和鉴定DHFR缺陷型CHO无胸腺嘧啶的培养基二氢叶

33、酸还原酶(DHFR)基因促进THF合成DNA重组体遗传互补Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics115（二）重组子结构特征的筛选1重组子大小鉴别筛选 2酶切鉴定3PCR筛选法4核酸杂交技术筛选5. DNA序列分析五、重组体的筛选和鉴定PCR法已知目的序列的长度和两端的序列，则可以设计合成一对引物，以转化细胞所得的DNA为模板进行扩增，若能得到预期长度的PCR产物，则该转化细胞就可能含有目的的序列。DNA限制性内切酶图谱分析DNA测序 Southern印迹 菌落杂交鸡的肌球蛋白的克隆和检出免疫学方法 Zhejiang Provincial

34、Key Lab of Medical Genetics122外源基因表达操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交目的基因（外源基因）基因组DNA cDNA人工合成PCR产物Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics123原核表达系统：表达载体表达宿主真核表达系统：酵母细胞表达系统昆虫细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统六、目的基因的表达 目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线5. 目的基因表达 原核细胞外源基因转录:原核生物启动子Pri

35、bnow box(-10 sequence)Sextama box(-35 sequence)Pribnow box 和Sextama box的距离(16-19bp)启动子受控制外源基因的翻译SD序列,核糖体结合位点SD序列与起始密码子的距离：5-13bpmRNA的结构密码子的偏爱性5. 目的基因表达 真核细胞转录真核生物启动子TATA box （-25 -30）CAAT box （-70 -80）GC box （-80 -110）上游调控元件：cAMP应答元件、糖皮质激素应答元件、 特异信号应答元件增强子沉默子终止子加尾信号翻译：Kozak序列：CCACCAUGG原核细胞表达系统大肠埃希菌表

36、达载体启动子lac启动子：IPTGtrp启动子：吲哚烯酸tac启动子：IPTGpL启动子：42T7噬菌体启动子： T7噬菌体溶原菌载体系列：pGEM系列、pET系列、pMAL系列等。宿主细胞：大肠埃希菌宿主细胞的改造1. 通过改变载体的抗性基因或将外源基因插入染色体 中来控制拷贝数；2. 通过代谢工程改造宿主细胞，使之能在细胞中催化 二硫键形成；3. 通过定向突变对蛋白酶进行突变防止重组蛋白分解；4. 筛选具有糖基化的大肠杆菌；5. 筛选不同密码子偏爱性的宿主细胞；6. 选择RNase缺陷型的大肠杆菌为受体菌，增强mRNA的稳定性原核细胞表达系统芽孢杆菌：优点1、细胞壁的组成简单，只含有肽聚糖

37、和磷璧质，因此在分泌的蛋白质产品中不会混杂有胞被内毒素（热源性脂多糖），而这一点是大肠杆菌无法比拟的。2、能够大量分泌某些胞外蛋白，蛋白跨越细胞膜后，被加工和直接释放到培养基中而不发生聚集，回收和纯化蛋白较为简单。3、没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包涵体。缺点：1、存在限制和修饰系统，重组质粒不稳定。2、能自发形成感受的的菌株极少，感受态持续时间短暂，分子克隆效率低。3、能够产生大量的胞外蛋白酶，往往造成表达产物的大量降解。真核细胞表达系统酵母细胞表达系统昆虫表达系统哺乳动物细胞表达系统克隆基因在大肠杆菌中的表达融合蛋白：原核启动子SD序列原核起始密码原核结构基因片段真核结构

38、基因原核终止密码终止子非融合蛋白：原核启动子SD序列真核起始密码及结构基因原核终止密码终止子分泌型蛋白：原核启动子SD序列信号肽序列真核起始密码及结构基因原核终止密码终止子基因工程蛋白的分离纯化 精细纯化粗级分离 胞内表达胞外表达重组蛋白质的分离纯化美国GE公司蛋白质分离纯化装置 上海厦美公司蛋白分离层析系统分部收集器记录仪蠕动泵梯度混合仪蛋白质产物的性质 方 法 电荷（等电点） 离子交换（IEX） 分子量 凝胶过滤（GF） 疏水性 疏水（HIC）反相 （RPC）特异性结合 亲和（AC） 蛋白质分离方法的选择选择分离纯化方法的依据1.根据产物表达形式来选择分泌型表达产物： 发酵液体积大、浓度低,先浓缩（沉淀、超滤/最常用）。周质表达产物： E.coli经低浓度溶菌酶处理,再用 渗透压休克法，杂蛋白少，易纯化。细胞内可溶性表达产物（融合蛋白）： 破菌后的可溶性离心上清液,首选亲和层析分离方法（pBG-2 融合表达），或选用离子交换色谱包涵体内表达产物： 包涵体对蛋白质分离纯化的影响: 1.很容易与胞内可溶性蛋白杂质分离,重组蛋白纯化较容易完成; 2.包涵体中重组蛋白质产物经过了一个变性复性过程,较易形成蛋白产物的错误折叠和聚合体。包涵体的分离和重组蛋白质的纯化步骤: 细菌收集与破碎 包涵体的分离 洗涤与溶解 变性