多发性骨髓瘤病人预后相关lncRNA研究讲述

1、多发性骨髓瘤病人预后相关IncRNA研究AbstractBackgournd： IncRNA在肿瘤的发生发展的过程往往扮演着十分重要的作用, 表明很多的IncRNA可能作为诊断或者判定肿瘤的潜在的标志物。然而，利用 IncRNA表达评价多发性骨髓瘤病人的预后悄况的研究并不多见。Materials and methods：我们从GEO数据库中获取了大规模的基因表达谱 芯片的数据(包括GSE24080和GSE57317),我们从GSE24080数据集中注 释得到相关IncRNA,然后找出于病人生存情况相关的IncRNA,利用这些IncRNA 的表达量预测病人的预后，并且独立的数据集(GSE5731

2、7)中进行验证。并且 我们进行了 GSEA分析，找出IncRNA可能通过哪种生物学通路影响病人的预 后。Results：对基因芯片进行IncRNA注释后，我们共得到2096个IncRNA, 对这些IncRNA进行Univariable Cox regression分析后，我们发现共有176个 IncRNA的表达与病人生存显著相关(pv0.05)。通过这仃6个IncRNA的表达 量对病人进行聚类分析后，我们发现聚类得到的两组病人生存率存在显著的差异, 独立的数据集(GSE57317)中进行验证也得到了同样的结果。Stratified analysis 表示该预测模型是独立于其他临床表型的，如se

3、rum beta 2-microglobulin (Sp2M), serum albumin (ALB)和 lactate dehydrogenase (LDH)浓度的。GSEA分析表明细胞周期、细胞周期过程中检验点的改变、细胞与细胞间的粘附 都发生了显著性的改变，IncRNA可能是通过促进细胞增殖，抑制细胞粘附等表 型促进了多发性骨髓瘤的进展。Conclusions：我们结果证明很多IncRNA可以作为评判多发性骨髓瘤病人 预后的生物标志物。这样标志物可能对多发性骨髓瘤的发生发展具有重要的作用, 其分子机制还需要更多的实验数据的证实。Keywords: IncRNA,基因芯片，多发性骨髓瘤，

4、生存率，GSEA1 Introduction多发性骨髓瘤是山骨髓中单克隆血浆细胞异常积累引起的一种难以治愈的 癌症1。多发性骨髓瘤是一种常见的肿瘤，其具有抑制性高、病理特征多等特点, 发性骨髄瘤常常导致很差的预后。多发性骨髄瘤患者的存活时间为儿周到10年 不等，五年生存率仅为40%作用2。鉴定高风险的多发性骨髓瘤病人可以针对 性的进行个性化治疗，这有利于改善病人的预后，提高病人的存活时间。长链非编码 RNA (long non-coding RNA,lnc RNA)是一类长度超过 200nt 的RNA分子，不编码蛋白或者只编码很短的多肽，起初被认为是垃圾序列，不 具有生物学功能。但随着研究的不

5、断深入，科学家发现，占基因组98%的这些非 编码RNA分子，通过与DNA、RNA、蛋白质的相互作用，参与细胞的增殖、代 谢、运动、自噬及凋亡等诸多生理过程，在基因表达调控网络中扮演着十分重要 的角色，IncRNA参与基因组印记以及染色质修饰，转录激活，转录后调控，蛋 口功能调节等多种重要的信号转导调控过程3。IncRNA的表达失调会引起基因 表达异常，从而导致疾病的发生4。IncRNA可以为判断多种类型肿瘤的预后提供很多有用的信息5-6o利用表 达谱数据判断病人的预后已经被应用于多种类型的肿瘤，例如：乳腺癌7、结直 肠癌8、前列腺癌9以及非霍奇金淋巴瘤等10。然而，将表达谱数据用于临床 中还碰

6、到了很多问题，包括过度拟合，缺乏验证，患者间组织的异质性，瘤内异 质性，忽视现在临床变量等。在现有的研究中，大规模整合多发性骨髓瘤表达谱数据和临床信息的研究并 不多见，我们发现了与多发性骨髓瘤病人生存相关的IncRNA,并且利用这些I 生存相关的IncRNA用于预测病人的生存情况，可能具有一定的指导临床评价的 作用。2 Materials and methods2.1多发性骨髓瘤病人GEO数据集以及相应临床信息我们从基因表达综合数据库(GEO)中获取了大量多发性骨髓瘤病人的表达 谱芯片数据，并且根据相应的注释文件，获取其相关的临床资料。包括： GSE2408011 (AffymetrixHGU

7、133_Plus_2.0array)( HYPERLINK /geo/query/acc.cgi?acc=GSE24080)%e6%95%b0%e6%8d%ae%e9%9b%86%e4%b8%ad /geo/query/acc.cgi?acc=GSE24080)数据集中 558 例多 发性骨髓瘤病人,GSE5731712(Affymetrix HG-U133_Plus_2.0 array) ( HYPERLINK /geo/query/acc.cgi?acc=GSE57317)%e6%95%b0%e6%8d%ae%e9%9b%86%e4%b8%ad /geo/query/acc.cgi?acc

8、=GSE57317)数据集中 55 例多发 性骨髓瘤病人。详细的多发性骨髓瘤病人的病理资料见Supplement table 1。2.2芯片数据处理和IncRNA注释我们使用了 RMA13算法标准化处理了芯片数据，并对标准化的芯片数据 进行 Z-score14处理。我们使 GATExplorer13I具对 Affymetrix HG- U133_Plus_2.0芯片的探针进行IncRNA注释。GATExplorer提供了一系列系 列用于注释芯片的R包，我们利用Bioconductor提供的affy包，可以获得来源 与GATExplorer的注释信息。我们从GATExplorer中下载了芯片中比

9、对到非编 码区域的 ncRNA 的 CDF 文件。通过 ncrnamapperhgu 133plus2cdf_3.0 文件, 我们获得了 IncRNA的表达谱数据。对于比对到多个IncRNA的探针，我们采取 了合并取平均值的方法进行处理。寻找与多发性骨髄瘤病人生存率相关的 IncRNA我们使用单因素Cox回归分析评价IncRNA表达量与病人生存时间的相 关性。我们保留了 pv0.05的IncRNA来预测多发性骨髓瘤病人的生存情况。利 用IncRNA表达量进行K-means聚类将多发性骨髓瘤病人区分为2组，进行 Kaplan-Meier 分析。2.3统计分析我们使用Kaplan-Meier生存曲

10、线来评价K-means聚类将多发性骨髓瘤病 人区分为2组时，这两组病人的生存情况的差异。我们采取双尾log-rank检验 来评价生存曲线是否具有统讣学差异。所有的分析都是使用R语言(323版本) 以及Bioconductor完成的。2.4 GSEA 分析我们使用Broad institute所开发的GSEA的JAVA程序进行 （/gsea）基因组富集分析（GSEA）,我们使用MSigDB中提供的基因集作为参照。我们认为当假阳性率（FDR） 0.05, 1000 次置换检验的p值小于0.05时，该通路在该种类型的样本中发生量显著改变。 我们使用Cytoscape和Enrichment Map对G

11、SEA的分析结果进行可视化。3. Results鉴定生存相关的IncRNA为了找到与多发性骨髓瘤病人生存率显著相关的IncRNAo针对GSE24080 数据集中的558例多发性骨髓瘤病人，我们使用单因素Cox风险比例模型来评 价IncRNA表达量与病人生存时间的相关性。共有176个IncRNA的表达量与病 人的生存情况显著相关（pd)o&o- -2.50.0z- score2.5Fig 1.绿色点表示表达量与病人生存情况呈负相关的IncRNA （87个）,红色点表示表 达量与病人生存情况呈正相关的IncRNA （84个），黑色点表示表达量与病人生存情况不 相关的 IncRNA （1920 个）

12、。（筛选阈值为：p1.8）Table 1与多发性竹髓瘤病人生存情况显著相关的IncRNA (Top20)Gene symbolchrom osomeStart positionEnd positioncoefz-scoreHazar d ratiop valueRP1-286D6.11368935236925460.340-4.3630.7120AC008875.254298550342993435-0.2963.9350.7440MTMR9L13269725932707282-0.341-3.5640.7110AC069360.2111087980610900823-0.280-3.4900

13、.7560.002AL512791.1149084986890854251-0.248-3.3870.7800AP001048.1214488518944887178-0.228-3.2700.7960AC096579.228906532489106126-0.226-3.1630.7980.001RP11-445H22.2204328509243324737-0.213-3.1450.8080.001CYorfl4Y2103438721239302-0.244-3.0820.7830.001U62317.2225096883850970543-0.250-3.0630.7790.001GN

14、ASAS2057393974574259580.2533.3101.2870RP11-305M3.271291423201291527590.2963.3571.3450.001AC012170.11550655998506604760.2573.3851.2930AC105388.1490166086901723450.3313.4611.3920AC005682.5722897143228981610.3073.4851.3600AC004687.21756402811564310770.2923.6311.3390AC138645.21744620700446227970.2813.81

15、51.3240AL138795.211501908611501928820.3423.8271.4080AC022087.21550647664506505010.3073.8781.3590AL591493.111498160661498205910.3244.0061.3820利用获得的IncRNA预测病人生存情况我们利用所获得的与病人预后相关的IncRNA的表达量，对来源于 GSE24080的559例多发性骨髓瘤病人进行聚类分析，我们发现利用这些176 个IncRNA的表达量，我们可以将558例病人分为预后良好和预后较差的两组 (Fig.2A) o Kaplan-Meier分析表明，利用

16、K-means聚类将多发性骨髓瘤病人 区分为2组时，这两组病人的总体生存率有显著性的差异(log-rank test p =0.0002, Fig.2B)。预后良好的病人的平均存活时间(平均存活时间:87.43月) 显著高于预后较差的病人(平均存活时间：64.56月)。手术切除的多发性骨髄瘤病人也呈现出同样的结果(log-rank test p AJns -_e 0Color Key6 -4 -20246valueBGSE57317 set (n=55)Fig 3.GSE57317数据集中，利用IncRNA表达量预测多发性竹髓瘤病人的总体生存情况。A.利用176个IncRNA的表达量对55个多

17、发性竹髓瘤病人进行k-means (k=2)聚类分析得 到的结果，可以将55人分为预后较好与预后较差的两组(n分别为32和23)。B.k-means (k=2)时，55例多发性竹髓瘤病人被分成两组时，其总体的Kaplan-Meier曲线情况。P值 是釆取双尾log-rank检验方法il算得到的。IncRNA表达量预测病人的生存情况独立于其他病理特征为了评估使用生存相关的IncRNA表达量预测病人生存情况的能力、是否独 立于其他多发性骨髄瘤病理特征。我们进行了分层分析，首先我们根据Sp2M的 浓度高低将558例多发性骨髓瘤病人分成高低两组，然后分别根据风险分数将 这两组的病人分成高风险和低风险两

18、组。我们发现在低浓度的Sp2M(3.5 mg/L) 病人中(n=318),使用IncRNA表达量进行k-means (k=2)聚类时，分出的两 组病人的 Kaplan-Meier 曲线有显著的差异(Log rank p test190 U/L和LDH浓度W190 U/L的两组的病人分成两组。我们发现在高浓度 的LDH病人中5=168) , k-means (k=2)聚类分出的两组其生存情况具有显著 性差异Fig 4Eo在低浓度的LDH病人中，我们也观察到了同样的结果。Fig 4FPatients with Sp2M 3.5 mg/L0(5-eAJns -2OO(Dle-eAJns -2OO o

19、 o o O 0 8 6 4 120good outcome,n=137poor outcome.n=18150100Time(Months)CDPatients with ALB 35 g/LPatients with ALB AJns -2 0Patients with LDH 190 U/LFig. 4对具有Sp2M . ALB和LDH信息的病人进行生存分析。A.低浓度Sp2M(3.5 mg/L)病人的Kaplan-Meier生 存曲线情况。C.高浓度ALB(3.5 g/L)病人的Kaplan-Meier生存曲线情况。D.低浓度 ALB(190 U/L)病人的 Kaplan-Meier生

20、存曲线情况。F.低浓度LDH(/uns =200鉴定IncRNA相关的通路和生物过程为了进一步探究，IncRNA在预后中的作用，我们进行了基因富集分析 (GSEA)，确定相关的生物过程和信号通路。我们比较了 GSE20480数据集 中，利用176个IncRNA表达量将558个病人分成两组，我们取这两组病人中 表达量出现显著差异的基因(FDR0.01,P 0.005)用于基因富集分析(GSEA)o 很多与肿瘤相关的通路都被发现与多发性骨髓瘤病人的预后相关(Fig5A-Fig5C), 如细胞周期的紊乱、细胞与细胞间粘附能力的改变等等。Enrichment plot: REACTOME.CELL.C

21、YCLE(S3) ceEUMUWEnrichment plot: KEGGFOCALADHESION【S3) C6EEUUU1Enrichment plot: HALLMARK_G2M_CHECKPOINT(secelu 匸UUUUJFig 5在GSE24080数拯集中，GSEA分析与IncRNA相关的生物学通路情况。A.细胞周期相关的信号通路B.细胞粘附相关的信号通路C.细胞G2期到M期检验点相关的信号通 路Discussi on多发性骨髓瘤是一种高度异质性的肿瘤，不同患者的生存惜况存在明显的差 异，准确地对患者进行预后分层，实行精准治疗是提高病人预后的关键途径。现 在，对多发性骨髓瘤进行预

22、后分层，主要通过是通过血清中SP2M、LDH、ALB 等蛋口含量来判断的。但是细胞分泌蛋口的能力不同，并且分泌蛋白的种类也各 不相同，蛋口的浓度与肿瘤恶性程度也并不完全成正比关系。因此，这样的这些 临床相关的预后因素并不能真实反映病人真实的预后情况。在这项研究中，我们利用GEO数据库中大样本的多发性骨髓瘤患者的芯片 数据，分析IncRNA表达与预后的相关性。并且结合患者的病理特征，我们发现 176个IncRNA的表达量与多发性骨髄瘤患者的生存显著相关。因此我们利用 k-means (k=2)聚类的方法以176个IncRNA的表达量对多发性骨髓瘤病人进 行聚类，Kaplan-Meier分析发现这

23、两组病人的生存情况有显著的统讣学差异。在 独立的数据集GSE57317中也观察到了同样的结果。我们还针对病理资料进行了分层分析，在对病理特征进行分层后，IncRNA 表达量仍然和病人的总体生存情况显著相关。与此同时，我们还发现SP2M.LDH 和ALB的浓度也与多发性骨髓瘤病人的总体生存状况显著相关。同时，我们想 了解到底IncRNA通过影响哪些生物学通路来影响了病人的预后，进行了 GSEA 分析后，我们发现在预后较差的病人中，其细胞周期、细胞与细胞间的粘附都发 生了显著性的改变，可能是通过促进细胞增殖，抑制细胞粘附等表型促进了多发 性骨髓瘤的进展。综上所述，我们找到了很多与多发性骨髄瘤预后相

24、关的IncRNA,并且对其 影响预后机制进行了一定的分析，具有一定意义的临床适用性与指导性，但是需 要通过实验证实我们的观点参考文献:1Palumbo, A., and Anderson, K. (2011). Multiple myeloma. The New England journal of medicine 363, 1036-1060.Decaux. O., Lode, L., Magrangeas, F., Charbonnel, C., Gouraud, W., Jezequel, P., Attal, M., Harousseau, J.L., Moreau, P., Bat

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