十大功劳体外抗H3N2型猪流感病毒的作用研究(共8页)

1、 PAGE 12十大功劳(gng lo)体外抗H3N2型猪流感病毒的作用(zuyng)研究(ynji)摘要：采用水煎法提取十大功劳水煎液，测定其对MDCK细胞的最大安全浓度为0.977mg/ml。将最大安全浓度的十大功劳水煎液倍比稀释，并通过三种不同的加药方式，采用MTT法观察十大功劳在MDCK细胞上对H3N2猪流感病毒的作用效果。结果表明十大功劳在对MDCK细胞的安全浓度范围内，对H3N2猪流感病毒没有明显的阻断作用和抑制的作用。关键词：十大功劳水煎液；H3N2型猪流感病毒；体外作用；MTT法Studies on the Activity of Mahonia Fortunei on H3N

2、2 Subtype SIV in VitroYANG Shu(Class 1 of Animal Medicine, Graduated in 2013)Abstract: In this experiment，Mahonia Fortunei decoction was extracted from Mahonia Fortunei by waterextraction and was added into MDCK cells to observe their effects on the MDCK cells proliferation.The maximum safe concentr

3、ation is 0.977mg/ml.Then,the Mahonia Fortunei decoction and H3N2 subtype swine influenza virus(SIV) was add into MDCK cells by the following three ways:adding medicine firstly,adding virus firstly and adding medicine and virus simultaneously to observe their anti-virus functions.MTT colorimetric ass

4、ay was used to detect the effects of the Mahonia Fortunei decoction.The results showed that in the safe concentration scope,Mahonia Fortunei does not have a good blocking and inhibitory action to SIV in vitro.Key words:Mahonia Fortunei decoction;H3N2 subtype SIV;Activity in vitro;MTT猪流感(swine influe

5、nza，SI)主要是由正黏病毒科甲型流感病毒引起的猪的一种急性、高度接触性呼吸道传染病，以突发、咳嗽、呼吸困难、衰竭、迅速康复或死亡为特征，各年龄、性别和品种的猪均能感染，发病率高，恢复缓慢，阻碍增重，降低肉料比，直接影响猪群健康状态，是规模化养猪场普遍存在且难以根除的猪群发性疾病之一，对养猪业危害极大。此外，SIV还可引起呼吸道细菌和病毒的继发或混合感染，使疫情更为复杂，死亡率增高，由此引起的经济损失更无法估量1。猪群中一旦出现流感病例，即迅速传播，发病率可达100，但病程很短，一般l3周可自行康复。目前猪流感病毒(SIV)血清亚型至少发现有H1N1、H1N2、H1N7、H3N1、H2N3、

6、H3N2、H3N6、H4N6、H5N1、H9N2等10种，广泛流行于猪群中的主要有古典型猪H1N1、类禽型H1N1和类人型H3N2毒株。猪流感不但给养猪业带来威胁，对人与其他动物的健康也带来难以预测的影响。十大功劳(gng lo)为小檗科 HYPERLINK /view/585715.htm t _blank 十大功劳(gng lo)属植物(zhw)，全世界约有100多种。是一种常见的观赏性植物，主要分布于西亚、东亚及中北美地区。在我国境内约有50多种，主产于长江以南及台湾各省。其中以阔叶十大功劳、细叶十大功劳和华南十大功劳比较常见。又名土黄连、刺黄芩。十大功劳在我国民间药用已久，具有清热燥湿

7、、泻火解毒、暇阴益肺、兼补肝肾之功效2。该属植物主要以根、茎、叶入药，以根、茎入药的称为功劳木，以叶入药的称为功劳叶3。其中含有多种活性成分，主要是生物碱，迄今至少从该属植物里分离了20多种生物碱，分别是小檗碱、巴马亭、药根碱、异汉防己碱甲素、氧化小檗碱、非洲防己胺、黄连素、小檗胺、异汉防己甲素、四氢药根碱、黄皮树碱、木兰花碱、木兰胺、黄小檗胺、异波尔定等。另外也含有一些非生物碱成分，如咖啡酸十六烷酯、丁香苷、2-羟基-3-甲基-4H-吡喃-4-酮、4-羟基-3,5二甲氧基苯甲酸、2,6-二甲氧基苯醌、3-羟基-4-甲氧基-苯甲酸、胡萝卜苷和蔗糖等4。在现代医学研究中，十大功劳具有抗菌5,6、

8、抗病毒7,8、抗肿瘤作用9,10,11并且具有抗炎抗增值活性12,13以及扩张血管14等作用。在中医的病因病理学说中，疫疠和六淫(风、寒、暑、湿、燥、火)同属于外感致病因素，多从体表、口、鼻、肺经等侵袭机体，初期表现为肺卫证侯。遵循中医辨证论治的观点，对于疫疠造成的疫病，多选用清热泻火、清热燥湿、清热解毒、清热凉血等治疗原则，对于热毒造成的气亏血虚、阴虚，还要选用补气血、滋阴生津的药材辅助治疗，这就给中药治疗病毒性疾病提供了中医基础理论15。中草药源自天然，经过几千年的筛选，药效确实、毒副作用小，残留量小甚至无残留，具有保健、治疗、康复等综合作用，并以整体调节机体内一切抗病因素、抵御疾病、增强

9、免疫力而越来越受到人们的关注。作为传统医学精华的中药，在中国有着丰富的生产和加工量，长期的医疗实践也使得对多种中药的性能功效有着清楚的了解，因此，将中药应用于畜牧业生产，用现代医学的观点再重新研究中药的调节机体免疫和抵抗外界病原微生物的侵袭作用，有着独特的优势16。徐振娜等17为了观察10种中药抗猪流感病毒的效果，通过先加中药再加病毒、先加病毒再加中药以及中药和病毒混合后一起加3入种加药方式，采用鸡胚培养法和红细胞凝集(HA)试验研究了桂枝等10种中药在体外抗猪流感病毒的效果。然后，将有显著效果的中药筛选出来，测定其治疗指数(TI)和半数有效量(ED50)。试验结果表明，在3种加药方式中，桂枝

10、和麻黄抗猪流感病毒的效果最为显著。邱美珍等18将猪流感病毒分别和地锦草，黄连、蒲公英提取液混合接种到911日龄鸡胚，继续孵化，记录鸡胚死亡时间和测定死亡鸡胚尿囊液血凝价，结果表明地锦草对猪流感病毒没有作用，黄连和蒲公英对猪流感病毒有一定的抑制作用，减缓了鸡胚的死亡，降低了血凝效价，但是对病毒不能完全杀灭。曾详英等7以Mahomia bealei为原料，以鸡胚试验技术为辅助手段进行筛选，发现Mahomia bealei中的生物碱成分具有良好的抗流感病毒作用。Okunade AL等8的研究表明小檗碱能够抑制与AIDS致病相关的白色念珠菌，这种作用是通过和酶以及模板的相互作用，抑制人体免疫缺损病毒反

11、转录酶(HIV一1RT)而实现的。另外，小檗碱的抗病毒的作用机理可能是小檗碱能插入DNA中，从而抑制DNA的合成和反转录。本实验应用煎煮法获取十大功劳水煎液，并通过不同的加药方式进行十大功劳对H3N2型猪流感病毒(SIV)体外作用的研究，旨在了解十大功劳在MDCK细胞上对H3N2型猪流感病毒的体外作用，从而为研制新型抗H3N2型猪流感病毒的药物制剂提供理论依据。1 材料(cilio)与方法1.1 试验时间(shjin)、地点本试验(shyn)于2013年3月至2013年5月在河南省动物性食品安全重点实验室进行。1.2 十大功劳水煎液的提取十大功劳产自河南，按照常规的煎煮法进行提取。取100g药

12、物用蒸馏水浸泡2h；浸泡后煎煮药物1.5h后留液体；加入蒸馏水进行稀释，再煮1h,留液体。将前两步中的液体混合后用滤纸过滤，然后用旋转蒸发仪将其浓缩至100ml,高压，4备存。1.3 毒株、细胞H3N2型猪流感病毒和MDCK细胞由河南省动物性食品安全重点实验室保存、传代，按常规方法进行培养。1.4 试剂DMEM培养基(GIBCO公司产品)、小牛血清(Hyclone公司产品)、细胞生长液(含10小牛血清)、细胞维持液(含2小牛血清)、胰蛋白酶(0.25)、PBS缓冲液、7.4NaHCO3、双抗(青霉素100gmL、链霉素100 gmL)、MTT（用pH7.4 PBS配制成5mg/ml的溶液）、D

13、MSO溶液。1.5 仪器 二氧化碳培养箱（SANYO/MCO-15A型）、倒置显微镜（江南/XD-202型）、细胞培养瓶、96孔细胞培养板(CoringCostar产品)、双人双面净化工作台（苏州净化/SW-CJ-2F型）、酶标仪（Thermo/Multiskan Fc型）。1.6 病毒TCID50的测定按常规方法将细胞传代，将细胞数调整至1106个/ml,加至96孔板上，0.1ml/孔。待细胞培养成单层后，弃液。加入不含血清营养液2倍比稀释的病毒液（2-4 2-13），0.1ml/孔，每个稀释度重复4孔，作用1.5h后吸出，加维持液100L/孔。设正常细胞对照和空白对照。于375% CO2培

14、养箱观察培养72h；待培养68h后，弃去旧液，加入MTT 20L/孔，37继续培养4h。弃去MTT残液，加入DMSO 150L/孔，震荡10min后，于492nm测定OD值。按ReedMuench公式计算TCID50。病毒稀释液对细胞生长破坏率=（细胞对照组OD-试验组OD）/（细胞对照组OD-空白对照组OD）距离比例=（高于50%细胞生长抑制率-50%）/（高于50%细胞生长抑制率-低于50%细胞生长抑制率） Log2TCID50=距离比例稀释度对数之间的差+高于50%细胞生长抑制率对数1.7 细胞安全浓度的测定细胞按常规方法传代后，将细胞数调整至1106个/ml,接种到96孔板上，100L

15、/孔。待细胞铺满单层后，弃掉培养液。用维持液将药物倍比稀释（2-62-14），每孔加入药物和细胞维持液各100L，每个浓度重复4孔。对照孔不加药物，只加细胞维持液200L/孔。于375% CO2培养箱培养观察。待培养68h后，弃去旧液，加入MTT 20L/孔，37继续培养4h后弃液。加入DMSO 150L/孔，震荡10min后，于492nm测定OD值。细胞抑制率=（细胞对照组OD-试验组OD）/细胞对照组OD将对细胞生长没有明显抑制作用的最大药物浓度作为起始药物浓度。1.8 不同(b tn)加药方式下十大功劳对H3N2型SIV体外作用(zuyng)的测定1.8.1 十大功劳(gng lo)对S

16、IV抑制作用（先加药物后加病毒） 将对细胞生长没有抑制作用的最大药物浓度作为起始药物浓度倍比稀释成6个稀释度，将每个稀释度的药液加入到长成单层的MDCK细胞的96孔培养板上，100L/孔。每个稀释度做4个重复，于375% CO2培养感作4小时，弃去药液，加入4个TCID50的病毒液100L/孔，同时设置正常细胞和病毒对照。于37 5%CO2继续培养，每天观察CPE，当病毒对照CPE达到80以上时加入MTT 20L/孔，37继续培养4h后弃液。加入DMSO 150L/孔，震荡10min后，于492nm测定OD值。1.8.2 十大功劳对SIV阻断作用(先加病毒后加药物) 先将4个TCID50病毒液

17、接种至长成单层MDCK细胞的96孔细胞培养板上，100L孔，于375%CO2培养箱中吸附2小时，弃去病毒液。加入稀释好的药液，每个稀释度做4个重复，同时设置正常细胞、病毒对照。于37 5%CO2继续培养，每天观察CPE，当病毒对照CPE达到80以上时加入MTT 20L/孔，37继续培养4h后弃液。加入DMSO 150L/孔，震荡10min后，于492nm测定OD值。1.8.3 十大功劳对SIV直接杀灭作用(病毒和药物同时加入) 取4个TCID50的病毒液与各稀释度的药液以等体积混合，于37感作2小时，以100L/孔加入到长成单层MDCK细胞的96孔细胞培养板上，每个稀释度做4个重复，同时设置正

18、常细胞、病毒对照。于375%CO2继续培养，每天观察CPE，当病毒对照CPE达到80以上时加入MTT 20L/孔，37继续培养4h后弃液。加入DMSO 150L/孔，震荡10min后，于492nm测定OD值。1.9 数据分析整理数据后，用SPSS19.0数据处理系统进行单因素方差分析和多重比较，得出各组数据的差异以及相关性。2 结果与分析2.1 H3N2型SIV的TCID50测定结果表1 H3N2型SIV对MDCK细胞生长(A492)的影响Table 1 Effects of H3N2 subtype SIV on MDCK cells growth病毒稀释倍数Added concentrat

19、ionOD值OD Values细胞破坏率(%)Rate of cell destruction40.21760.007364.9050.28620.005349.2960.30380.004945.2970.34160.007136.6980.42480.016117.7590.4550.008910.88101112130.46260.01590.48440.00500.46320.00760.46040.01429.154.199.019.65细胞对照Cell control空白对照Blank control0.50280.01560.06340.0011注：“”表示细胞生长良好(ling

20、ho)，破坏率为负。： OD值为MeanSD。按ReedMuench公式(gngsh)计算H3N2型SIV的TCID50为2-4.95/0.1mL.2.2 十大功劳对MDCK细胞的安全(nqun)浓度的测定 由表2可知，当药物浓度是0.9770.061mg/mL时，药物对细胞没有抑制作用。本试验采用对细胞生长没有抑制作用的最大药物浓度作为起始药物浓度。 十大功劳在质量浓度为0.061mg/mL时，其A492值显著大于细胞对照组，表明这个浓度的十大功劳能显著促进MDCK细胞生长。表2 十大功劳对MDCK细胞生长(A492)的影响Table 2 Effects of Mahonia Fortune

21、 on MDCK cells growth药物添加质量浓度/(mg/mL)Added concentrationOD值OD Values细胞抑制率(%)Rate of cell inhibition15.6250.29030.0093a37.527.8230.32430.0274a30.203.9060.42830.0379b7.821.9530.45170.0365bc2.800.9770.47370.0309cd0.4880.47500.0201cd0.2440.1220.0610.47070.0132bc0.48830.0208cd0.51770.0040d细胞对照Cell contro

22、l0.46470.0124bc注：同列数据肩标不同字母者表示在0.05水平差异显著。：“”表示细胞生长良好，抑制率为负。 ：OD值为MeanSD。2.3 不同加药方式下十大功劳对H3N2型SIV体外作用的测定2.3.1 十大功劳对SIV抑制作用（先加药物后加病毒）的测定 从表3可知除了在药物浓度为0.061mg/mL时，其A492值高于病毒(bngd)对照组但无显著差异；其余各组A492值均显著低于病毒(bngd)对照组。表明采用(ciyng)先加入十大功劳后接种病毒这种加药方式时十大功劳成分对SIV感染MDCK细胞没有显著的抑制作用。表 3 先加十大功劳再加病毒时各处理组的A492值Tabl

23、e 3 A492 values of different treatments when adding Mahonia Fortunei firstly then followed by virus药物添加质量浓度/(mg/mL)Added concentrationOD值OD Values0.9770.30230.1580b0.4880.28130.1806b0.2440.21780.1063a0.1220.33930.1162c0.0610.39100.3126d0.0310.21200.0346a病毒对照Virus control细胞对照Cell control0.38600.0887d

24、0.50430.0512e注：同列数据肩标不同字母者表示在0.05水平差异显著。：OD值为MeanSD。2.3.2 十大功劳对SIV阻断作用（先加病毒后加药物）的测定 从表4可知十大功劳质量浓度为0.9770.031mg/mL时，其A492值均显著低于病毒对照组。表明采用先加入病毒后加入十大功劳成分这种加药方式时对SIV感染MDCK细胞没有显著的阻断作用。表 4 先加病毒再加十大功劳时各处理组的A492的值Table 4 A492 values of different treatments when adding virus firstly then followed by Mahonia

25、Fortunei药物添加质量浓度/(mg/mL)Added concentrationOD值OD Values0.9770.09130.0095a0.4880.11770.0032a0.2440.12870.0015a0.1220.14370.0301b0.0610.12000.0079a0.0310.11530.0246a病毒对照Virus control细胞对照Cell control0.15300.0135b0.91800.0453c注：同列数据肩标不同字母者表示在0.05水平差异显著。：OD值为MeanSD。2.3.3 十大功劳对SIV直接杀灭作用（药物和病毒同时加入）的测定 由表5可

26、知，病毒与药物感作后同时加入，十大功劳质量浓度为0.9770.031mg/mL时，其A492值均显著低于病毒对照组。表明在此加药方式下十大功劳成分对SIV感染MDCK细胞没有显著的直接杀灭作用。表5 病毒与十大功劳同时加入时A492的值Table 5 A492 values of different treatments when adding Mahonia Fortunei and virus at the same time药物添加质量浓度/(mg/mL)Added concentrationOD值OD Values0.9770.24430.0175a0.4880.26580.0091b

27、0.2440.27450.0076b0.1220.28050.0087b0.0610.27630.0090b0.0310.26850.0222b病毒对照Virus control细胞对照Cell control0.31480.0154c0.43480.0081d注：同列数据肩标不同(b tn)字母者表示在0.05水平差异显著。：OD值为MeanSD。3 分析(fnx)与讨论3.1 病毒(bngd)对细胞的破坏性 本实验表明，H3N2型SIV对于细胞具有较高的破坏性，细胞破坏率为9.65%64.9%。其TCID50为2-4.95/0.1mL。程珏益等19进行的关于猪流感病毒的分离鉴定和毒力检测实

28、验得出H3N2型猪流感病毒在MDCK细胞上的TCID50为10-6.5/0.2mL。这种差异的产生可能是所使用病毒毒株不同以及病毒的加入量不同造成的。3.2 十大功劳成分有促进MDCK细胞生长的作用本实验表明当药物浓度为0.9770.061mg/mL时，药物对细胞没有抑制作用。试验观察了十大功劳成分在一定质量浓度范围内对MDCK细胞生长的影响，发现其大多数孔的A492值大于细胞对照组，当浓度为0.061mg/mL时其A492值显著大于细胞对照组，表明它有显著的促进细胞增殖作用。而且在安全浓度范围内，十大功劳在低浓度时的A492值显著高于高浓度时，表明十大功劳成分促进MDCK细胞生长的作用有一定

29、的量效关系。这说明中药成分必须有合适的剂量才能发挥最佳效应。徐玉凤等20也持相同的观点，但这种作用机制尚有待进一步研究。3.3 不同加药方式下十大功劳的抗病毒作用 近年来的研究结果表明，中草药抗病毒的作用机理可分为直接途径和间接途径两种。直接途径表现为直接灭活或抑制病毒繁殖；间接途径表现为通过提高机体免疫功能或诱生干扰素而达到抗病毒作用。 A492值反映了活细胞的数量及其活性，可间接反映出病毒在细胞上的增殖情况，病毒增殖越多则A492值越低。本试验采用3种加药方式：先加中药再加病毒目的是观察中药能否抑制病毒的吸附和侵入；先加病毒再加中药目的是观察中药能否对已进入细胞的病毒起作用，阻断其生物合成

30、及成熟释放；中药和病毒混合后同时加入目的是观察中药对病毒的直接杀灭作用。结果表明，三种加药方式下，十大功劳对H3N2型SIV无显著的抑制、阻断和直接杀灭作用。在三种加药方式中，我们发现只有采用先加入十大功劳后接种病毒这种加药方式的数据中，在药物浓度为0.061mg/mL时，出现了A492值高于病毒对照组的情况，但差异不显著。因此笔者认为，当采用此种加药方式时，十大功劳可能对H3N2型SIV病毒感染MDCK细胞有抑制作用。本试验是筛选不同中药以及不同药物成分实验中的其中一步，虽然十大功劳水煎液对H3N2型SIV无显著作用，但其他中药或成分可能对该病毒有作用；实验室还从未做过关于十大功劳的试验，此

31、次试验可以说明十大功劳水煎液对H3N2型SIV无显著作用；本次试验是体外试验，实验室中其他同学做的关于十大功劳的小鼠体内试验表明该药对体内细胞免疫调节能力较好，说明该药虽然直接杀灭病毒的能力较弱，但具有调节细胞免疫的能力，可以与体外抗病毒作用良好的药物联合应用。曾祥英等7实验表明十大功劳生物碱成分在鸡胚上有良好的抗H1N1流感病毒的作用。而我们初步探索十大功劳水煎液在细胞上的抗H3N2型猪流感毒作用，并未得出明显的实验结果，与前文所述有所差异。因此十大功劳生物碱成分在细胞上的抗病毒作用还有待进一步研究。另外，试验过程中操作不当或者毒的效力以及细胞的成长状态有差异等原因均可影响实验结果以及重现性

32、。因此，在今后的试验过程中，我们应该选择合适的试验材料并且不断探索改进操作方法，锻炼扎实的试验技能，提高实验的重现性，以减少其他因素对试验的影响。 参考文献：1 李海燕,李雁冰,于康震, 等. 猪流感病毒的分离(fnl)鉴定J.中国(zhn u)预防兽医学报,2002,24(1):1517.2 董雷, 杨晓红, 刘银燕(yn yn), 等.十大功劳属植物的药理作用研究进展J.中国现代药物应用,2007,1(6):7275.3 吕光华.高效液相色谱法测定十大功劳属植物中的7种生物碱成分J. 药物分析杂志,1999,19（4）:271.4 李燕.中药十大功劳的化学成分和活性研究进展J. 广东化工,

33、2012,39(17):175.5 Cernakova M,Kostalova D. Antimicrobial activity of berberne-a constituent of Mahonia aquifoliumJ. Folia Microbiologica,2002,47(4):375378.6 Vollekova A,Kost alova D,Kettmann V.Antifungal activity of Mahonia aquifolium extract and itsmajor protoberberine alkaloidsJ.Phytotherapy Resea

34、rch,2003,17(7):834837.7 曾祥英,劳邦盛,末熙昌, 等.阔叶十大功劳根中生物碱组分体外抗流感病毒实验研究J.中药材,2003,26(1): 2930.8 Okunade AL,hufford CD,Richardson MD, et al. Antimicrobial properties of alkaoids from xanthorhizasimplicissimaJ.Pharm Science,1994,83(3):404406.9 刘泽,蔡少平, 等.小檗碱抑制结肠癌细胞中COX-2表达作用的研究J.中国新药杂志,2004,13(9):7910 Rackova L,Majekova M,Kost alova D.Antiradical and antioxidant activities of alkaloids isolatedfrom Mahonia aquifoliumJ.Bioorganic and Medicinal Chem,2004,12(1