大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验

1、河南农业大学本科生毕业论文（设计）题目鸡大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验学院牧医工程学院专业班级2011届动物医学专升本3班学生姓名王张凡指导教师许兰菊（教授）撰写日期：2011年5月10日河南农业大学牧医工程学院动物医学专业2011届毕业论文 鸡大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验王张凡(2011届动物医学专升本3班)摘要：为了对巩义某鸡场疑似鸡大肠杆菌病的鸡群进行确诊，并为有效防治提供依据，本研究利用细菌学检验方法对采集的典型病料进行细菌分离鉴定和细菌药敏试验。通过细菌分离培养、形态学观察、生化试验、动物试验和血清学试验。结果表明：该鸡群中分离到的病原菌为鸡大肠杆菌。动物攻毒试验结果表明:分离的鸡大肠

2、杆菌具有明显的致病作用，雏鸡发病率为100%(5/5)，死亡率达60%(3/5)。血清学鉴定结果显示，该分离菌血清型为O。药敏试验结果表明：该细菌对头孢曲松、头孢唑林、阿米卡星、复方新诺明(磺胺甲恶唑)、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、氨苄西林、米诺环素和庆大霉素均敏感，对阿莫西林和阿奇霉素为中度敏感;但对罗红霉素和四环素耐药。本研究结果对准确诊断和有效防治该病提供了依据和条件。关键词：鸡；大肠杆菌；分离鉴定；药敏试验Isolation,IdentificationandAntibioticSensitivityTestofChickenEscherichiaColiwangzhangfan(C

3、lass3ofVeterinaryMedicine,Graduatedin2011)Abstract：InordertomakeadefinitediagnosisforthesuspendChickenEscherichiaColiaboutchickenhousefromGongyiandprovideareferenceforeffectivepreventionandtreatment.Thebacteriawasisolatedandidentifiedfromtypicalsamplesandantibioticsensitivitytestwasalsoadopted.Bybac

4、terialseparatecultures,morphologicalobservation,biochemicaltests,animalexperimentandserologicaltests,thepathogenofthischickensispathogenicE.colibacteria.Theresultofanimalexperimentshowed:thisEscherichiacolihadobviouslypathogenic;themorbidityofchicklingswas100%(5/5)andthemortalitywas60%(3/5).Serologi

5、caltestingresultsindicated:theserotypeofthisstrainwas0】.Theantibioticsensitivitytestresultsilluminated:thesensitivityofthestraintoceftriaxone、cefazolinandother8kindsofdrugweresensitive;andthedrugsensitivitytoamoxicillinandazithromycinareintermediate;butthestrainweredrugresistanttoroxithromycinandach

6、eomycin.ThisresearchprovidedascientificbasisandqualificationforexactdiagnosisandeffectivepreventionandtreatmenttoEscherichiacoli.Keyword：Chicken,EscherichiaColi,IsolationandIdentification,AntibioticSensitivityTest鸡大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(avianpathgenicityE.coli,APEC)引起的急性或慢性细菌性传染病，各种日龄的鸡均可发病，但雏鸡和产蛋鸡更易发病，其常与

7、其他疾病混合感染加重病情，该病表现不同的病型，常见的病型有急性败血症、气囊炎、腹膜炎、卵巢炎、输卵管炎、脐炎、肉芽肿等1，2。现有的研究表明，APEC抗原性复杂、血清型多样，不同种类之间和不同地区之间致病菌的血清型差别很大4。鸡大肠杆菌病一年四季均可发生，各品种和各年龄的鸡均可感染，尤其是雏鸡发病率最高，可达55%以上。若不及时采取有效的防治措施，便会导致大量死亡，病死率可达75%100%；成鸡一般为慢性或隐性感染。其造成的生长发育迟缓、生产性能下降、饲料报酬下降、种鸡及产蛋鸡的蛋品品质下降和孵化率的降低、死淘率及屠宰废弃率增加以及药费的增加等,给养殖业造成了极大的经济损失。本研究对河南省巩义

8、地区鸡群发生的疑似鸡大肠杆菌病进行了临床初步诊断，并采集典型病料进行病原菌的分离鉴定与药敏试验，取得了理想效果，为该病的确切诊断和有效防治提供了可靠依据。现将有关情况报告如下：1材料与方法1.1试验地点、时间2011年3月1日4月30日在河南农业大学重点开放实验室工程楼0909室进行本研究。1.2病料来源与采集对来自巩义地区的疑似鸡大肠杆菌病的病例进行临床初步诊断，并无菌操作采集典型病料心、肝、脾、十二指肠等。1.3实验动物及分组一日龄健康罗曼雏鸡15只，购自于大河遗址孵化场。将雏鸡按照每组五只随机分为3组，其中攻毒组、空白对照组和普通营养肉汤对照组各一组。以上三组雏鸡均按正常饲养标准隔离饲养

9、，经过3天观察，各雏鸡均正常，以备攻毒试验。1.4主要试剂1.4.1培养基和生化鉴定管制备普通肉汤培养基，营养琼脂培养基，伊红美蓝琼脂培养基，麦康凯琼脂培养基，乳糖发酵管培养基，V-P培养基，MR培养基，以上培养基均按常规方法用配制。其所需试剂有：蛋白胨（批号：20100702），牛肉粉（批号：20080712），均由北京奥博星生物技术有限责任公司生产；氯化钠（批号:20110104），由天津市瑞金特化学品有限公司生产；琼脂粉由XinTaiinJapan生产；猪胆盐（批号：20090823），由北京双旋微生物培养基制品厂生产；乳糖（批号:20070308），由天津市北方天医化学试剂厂生产；中性

10、红（批号：2-60-12-15），次甲基蓝（美兰）（批号：4-61-08-20），均由中国公私合营新中化学厂生产；曙红Y（伊红）（批号：F20011209），由中国医药（上海）化学试剂公司生产；磷酸氢二钾（批号：20050906），由广西汕头市西龙化工厂生产；葡萄糖（批号:20070910），由中国郑州派尼化工试剂厂生产；麦芽糖（批号:19910926），由中科院上海生化所东风生化技术公司生产；甘露醇（批号：20081015），由北京中联化工试剂厂生产；蔗糖（批号：9840220），由北京化工厂生产。1.4.2革兰氏染液自制革兰氏染液，按文献要求配制6。1.4.3药敏纸片阿莫西林（10聘/片，

11、批号：100301），氨苄西林（10聘/片，批号：1009211），头抱唑啉（30聘/片，批号：1009171），头抱曲松（30聘/片，批号：1011031）,罗红霉素（15聘/片，批号：100531），庆大霉素（10聘/片，批号：1001201），阿米卡星（30聘/片，批号：1010221），米诺环素（30gg/片，批号：1010132），阿奇霉素（15聘/片，批号：101213）,磺胺甲噁唑（23.75/1.25聘/片，批号：1009031），四环素（30聘/片，批号：1008311），环丙沙星（5聘/片,批号：100901），诺氟沙星（10聘/片,批号：1009252）和氧氟沙星（5片g

12、/片，批号：1009022），均由北京天坛药物生物技术开发公司生产。以上药敏纸片均购自河南省生物所。1.4.4大肠杆菌诊断血清共26种O（5120*,批号20090416）,o（10240*,批号200901）,O5（2560*,批号200605）,O（2560*,批1号200901）,O（2560*,批号200901）,O（5120*,批号200904）,O（640*,批号200211）,O（5120*,批号200709）,O（5120*,批号200408）,Oin14151819（2560*,批号200709）,020（2560*,批号200407）,021（5120*,批号200901）

13、,O24（640*,批号200709）,O26（2560*,批号200709）,O35（5120*,批号200901）,O36（2560*,批号200505）,O50（2560*,批号200505）,O54（1280*,批号200709）,O74（1280*,批号200211）,O78（1280*,批号200612）,O（1280*,批号200901）,0“（10240*,批号200605）,On（640*,批号200104）,O（2560*,批号200901）,。（1280*,批号20080327）,0157（2560*,批号200901）,以上血清均购自中国兽医药品监察所，均在有效期内。用

14、时按照使用说明书要求进行稀释，4C保存备用。1.5主要仪器.超净工作台（型号：SW-CJ-IC），中日合资苏净集团安泰公司制造；高压蒸馏灭菌器（型号：LDZX-30KBS）,上海申安医疗器械厂制造；显微镜（型号:AC220VIN），重庆光电仪器总公司制造；恒温培养箱（型号：PYX-DHS-50X65-BS-II）,上海跃进医疗器械厂制造；电子天平（型号：11636920）,MadebySartoriusAG制造等。1.6分离鉴定方法1.6.1细菌分离培养用接种环无菌操作从病料中挑取病原菌，并接种于普通营养肉汤中进行增菌培养，然后分别在普通营养琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板划线，于37C培养24h。

15、1.6.2抹片染色镜检挑取分离到的可疑单个菌落进行抹片、革兰氏染色和油镜观察细菌形态排列及染色特性，镜检后将可疑单个菌落的剩余部分接于普通肉汤中做纯培养。染色方法按照文献要求进行9】。1.6.3生化试验参照文献6-8进行各项生化试验。将分离菌株分别接种于乳糖发酵管培养基、V-P培养基，MR培养基中，37C培养3d,观察并记录生化反应结果。1.6.4动物试验从分离的鸡大肠杆菌株，采用平板表面散布法进行活菌计数后，吸取肉汤纯培养物（平均浓度为30.7亿个/mL活菌）分别接种于3日龄雏鸡进行攻毒，采用腹腔注射0.2mL/只；用同样的方法给肉汤（介质）对照组雏鸡注射普通营养肉汤0.2mL/只；空白对照

16、组不做任何处理。接种后隔离饲养，观察每组发病和死亡情况，记录结果，剖检病变，并回收接种细菌。1.6.5血清学试验首先制备凝集抗原：将分离鉴定为大肠杆菌的菌株纯培养物，接种于营养肉汤中37C培养24h后，在无菌环境下用咼压灭菌过的棉球和镊子蘸取试管中的菌液，涂布于事先准备好的三个普通琼脂上37C培养24h后，在无菌环境下用移液器移取5mL生理盐水于平板上，再用高压灭菌过的涂布棒刮取菌苔，待全部刮干净后移入无菌三角瓶中；经121C高压灭活2h破坏细菌的K抗原；后将菌体抗原用4mL生理盐水洗涤离心洗涤四次，每次4000r/min离心20min,弃上清；之后加入2mL生理盐水反复吹打混匀，与标准麦氏比

17、浊管10比较，最终得到浓缩菌液（40亿菌/mL）共1.8mL；最后按6%的比例加入碱性美兰进行染色，4C保存备用。此方法制备的凝集抗原即为大肠杆菌0抗原。分离菌株的血清型鉴定参照参考文献11所述方法进行。用26种大肠杆菌单因子血清，对该大肠杆菌0抗原进行平板凝集试验，同时做标准菌株阳性对照和抗原阴性对照。1.7药敏试验采用平板表面散布法。将分离菌株的肉汤纯培养物均匀地涂抹于事先准备好的营养琼脂平板上，再将各种药敏片贴于营养琼脂培养基上，贴好纸片的平板于37C倒置培养18h，观察和测量药敏试验的抑菌圈直径，记录结果。分离菌株对各种药物的敏感性判定标准按有关文献进行12,13。2结果与分析2.1分

18、离培养特性采集病料经分离培养所得到的细菌在各种培养基中的培养特性如下：普通营养肉汤24h培养物，强混浊度，有菌膜有菌环，试管底部有粘稠絮状沉淀；营养琼脂平板上生长良好，37C24h后，形成凸起、表面光滑、湿润、半透明、灰白色、中等大小菌落（直径约2-3mm）；在麦康凯平板上均生长为表面光滑、边缘整齐、钝圆形、隆起的红色菌落；伊红美蓝琼脂平板上均生长为圆形、隆起、边缘整齐、表面光滑，黑色并有金属光泽的小菌落（直径1-2mm）。根据该株细菌的上述培养特性，初步判定其为鸡大肠杆菌。2.2细菌形态及染色特性挑取该分离菌株的单个典型菌落，进行革兰氏染色镜检。结果可见到2-3mm,两端钝圆，散在或成对存在

19、的卵圆形或短杆状得红色细菌。根据该株细菌的上述染色形态特征，进一步判定其为鸡大肠杆菌。2.3生化试验结果所分离菌株对葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、MR试验均呈阳性；V-P试验呈阴性。该分离菌株符合大肠杆菌的生化反应特性。详情见表1。表1鸡大肠杆菌生化试验检测结果Table1BiochemistryTestsResultofIsolatedE.coliStrains菌株名称甘露糖蔗糖MRVPStrainNames葡萄糖乳糖麦芽糖巩义株（肝）+巩义株（脾）+注：“+”为产酸；“-”为不分解；“”为产酸产气。Note:“+”meansacid-producing;“”meansnegativerea

20、ction;“”meansacid-producingandgas-forming.根据细菌形态染色特性，结合分离培养及生化特性鉴定结果，判定该分离到的菌株为大肠杆菌。2.4动物试验结果攻毒组雏鸡腹腔注射3h后开始发病。6h后个别鸡出现食欲不振、呆滞不动、精神沉郁、缩颈垂翅等，并呈现典型的腹泻，重者出现褐红色血便等症状。8h后开始死亡，濒死期的鸡陆续出现，表现为呼吸衰竭、抽搐蹬腿等严重症状。病死鸡均生长发育不良，身体瘦弱。连续观察7d,各攻毒组雏鸡的发病率为100%，死亡率60%。各组死亡情况详见表2。对全部病鸡、死鸡及时进行剖检观察，呈现不同程度病理变化，病情较轻者出现肝脏肿大变黄，肠道卡他

21、性炎症；重者则有气囊炎，腹膜炎，心包积液，肝脏、脾脏点状或散在出血，肠道黏膜出血。病程愈长者，病变愈明显。经伊红美蓝琼脂平板划线接种，均回收到原接种细菌。对照组雏鸡其临床表现和剖检均正常，未见任何肉眼变化，肝、脾等处也未分离出任何细菌。表2鸡大肠杆菌动物试验结果Table2ResultsofAnimalExperiment单位：h,只，%菌株名称StrainGroups68雏鸡死亡时间及数量TimeandAmountofDeadChicken168死亡总数Total死亡率Mortality101214204876104132160巩义菌株010101000000360空白对照组00000000

22、000000肉汤对照组00000000000000根据上述动物试验结果可知，该攻毒组雏鸡的临床症状及病理变化与自然感染后表现一致。2.5血清学试验结果见表3。表3分离菌株血清学试验结果Table3ResultsofSerologicalTests菌株名称00000000000000000000000000StrainName1258911141518192021242635365054747888111119141147157巩义+菌株注：“+”为凝集；“”为不凝集。Note:“+”meansagglutination;“一”meansnoagglutination.2.6药敏试验结果试验结果

23、的判定标准依据有关文献12,13报道的国家卫生部制定的标准进行判定：经检测，该鸡大肠杆菌对14种药物呈现出不同程度的药物敏感性。该株鸡大肠杆菌对头抱曲松、头抱唑林、阿米卡星、复方新诺明（磺胺甲恶唑）、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、氨苄西林、米诺环素和庆大霉素均敏感，对阿莫西林和阿奇霉素为中度敏感，但对罗红霉素和四环素耐药。详见表4。表4分离菌株药敏试验结果Table4ResultsofAntibioticSensitivityTest单位；d=mm抗菌药名称NamesofAntibiotics分离菌株Strain药物敏感性DrugSensitivity阿莫西林（AMX）17中度敏感氨苄西林/舒

24、巴坦17敏感(AM/SU)头抱唑啉（CZ）18敏感头抱曲松（CR0）22敏感罗红霉素（R0X）0耐药庆大霉素（GM）16敏感阿米卡星（AN）19敏感米诺环素（MN0）19耐药阿奇霉素（AZI）16中度敏感复方新诺明（SXT）23敏感四环素（TE）9耐药环丙沙星（CIP）28敏感诺氟沙星（N0R）27敏感氧氟沙星（0FL）26敏感3小结和讨论3.1本研究对巩义地区某发病鸡群的病料进行了细菌分离鉴定，结果判定为大肠杆菌，并证明该鸡群为鸡大肠杆菌感染引起的鸡大肠杆菌病，存在有0血清型，且毒力较强。药敏试验结果表明，该菌株对不同的药物敏感性存在一定的差异，但总体来说，对其敏感的药物较多。综上所述，该地

25、区应更加注重“防”，一旦发生该病，虽可用药物很多，但该地区菌株毒力强，仍可造成惨重损失。因此，对于鸡大肠杆菌病所造成的损失和影响，应引起大家的重视，采取有效措施进行综合防制。3.2通过动物攻毒试验发现大肠杆菌对雏鸡具有较强的致病作用：雏鸡的发病率为100%，死亡率60%。与唐一鸣14等报道华东地区肉鸡的发病特点有所差异，其发病率死亡率均较低。但与王贵升15等所报道的其他血清型（O147、O138等）的致病力相比，该血清型的死亡率较低，当然，不同血清型的致病力也有可能随着发病地区、鸡群品种等的不同而存在差异。可见，不同地区、不同品种的鸡感染不同血清型的大肠杆菌后的发病率和死亡率均有所不同。总之，

26、该血清型的菌株毒力较强，因此可引起临床上较高的发病率和死亡率，造成严重的损失。3.3血清学鉴定结果显示所分离菌株为大肠杆菌，对该株大肠杆菌血清学试验鉴定已鉴定出型，即0。此结果与DozoisCM16，田勇17等报道禽病原性大肠杆菌常见血清型为0、02、078结果基本一致，同时又与王丽荣冈等报道的豫北地区大肠杆菌主要血清型为0、02、078、011的结果相符。但不同地区又有不同的血清型，同一地区不同鸡群的血清型可能相同也可能不同16,17,18。由于大肠杆菌不同血清型之间的交叉保护率低，因此，针对不同发病地区应选择与该地区相对应的血清型或含有相同血清型的鸡大肠杆菌疫苗（即单一或多价疫苗）进行免疫

27、预防接种，才能起到有效的预防效果。因此，本试验的血清学鉴定结果，为本病的诊断和血清流行病学调查以及人工免疫防制提供了可靠的依据。3.4药敏试验结果为临床合理用药提供了可靠依据。药敏试验结果证明，本次分离到的大肠杆菌对多种药物具有很强的敏感性。这可能与该地区临床上不经常使用这些药物有关。本研究发现，该地区可使用头抱类药物、喹诺酮类药物（诺氟沙星、氧氟沙星以及环丙沙星）以及氨基糖苷类药物（庆大霉素和阿米卡星），但是该地区不可以使用如罗红霉素、阿奇霉素等大环内酯类药物来治疗其大肠杆菌病。此结果与MelzerM凹等所报道的人大肠杆菌耐受头抱类药物有所不同，但与R.Sharada20等所报道的大肠杆菌对

28、喹诺酮类药物敏感，对四环素、罗红霉素等耐药的结果一致。可见，不同地区的大肠杆菌对同种药物的敏感性不同。同时用此结果与其他不同血清型大肠杆菌的耐药性进行比较，又有所不同：据王贵升等报道，山东省部分地区的O2、O35、O78、O147型大肠杆菌对环丙沙星（氟喹诺酮类药物）、庆大霉素、磺胺类药物等的敏感性比较低；据魏蕻21等报道，四川成都市的O37型大肠杆菌对诺氟沙星、环丙沙星、氨苄西林、阿莫西林、氧氟沙星、复方新诺明100%耐药（5/5）,对庆大霉素、头抱氨苄和头抱唑啉60%耐药（2/5），对阿米卡星20%耐药（1/5）；据杨明凡凹等报道，河南省部分地区的O78型大肠杆菌株对环丙沙星高度敏感，对头

29、抱唑啉、恩诺沙星、/8阿米卡星为中度敏感，对庆大霉素、红霉素、氟哌酸、四环素、卡那霉素均有耐药性。从以上对比可见，不同血清型大肠杆菌对同种药物的敏感性不同；对于省内的鸡大肠杆菌，即使血清型不同，仍具有较高的药物敏感度相似性，只有个别药物具有较大差异（如庆大霉素、氟哌酸等），但对于省外，大肠杆菌对大多数药物的敏感性都与省内有明显不同，由此可见，不同省之间的大肠杆菌耐药性差异很大。因此在临床治疗上，应注意不同地区选择不同的敏感药物，并且交替轮换使用，才能有效减少耐药性的产生。总之，不同菌株或不同地区的同一菌株的药物敏感性均有所差异。因此，建议在生产实践中要选择敏感药物用于治疗，避免因细菌产生耐药性

30、而带来的不必要损失。综上所述，本研究试验结果对疑似鸡大肠杆菌病进行了确切诊断，并为有效防治该病提供了科学依据和有利条件，对指导养殖生产具有重要意义和应用价值。致谢：本试验研究是在指导老师的悉心指导下完成的，期间金钺老师、苗银苹等师姐给予了大力支持和帮助，在此表示衷心感谢！参考文献：1师福山，赵德明禽大肠杆菌的分离与16SrRNA的鉴定J.中国畜牧兽医,2009,36（2）:111-113.韩伟，张铁，王春光，等禽治病性大肠杆菌的分离鉴定与耐药性监测J中国兽医杂志,2007,43(7):41-42.于学辉，程安春,汪铭书，等鸭源致病性大肠杆菌的血清型鉴定及其相关毒力基因分析J畜牧兽医学报,200

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