2022年分子生物学实验教学教案

1、学习好资料 欢迎下载河南科技大学实验教学教案课 程 名 称 分 子 生 物 学指 导 教 师 李市场学习好资料 欢迎下载河南科技大学实验教学教案首页实验名称实验一、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验学时4 每次实验组数6 每组人数5 实验类型综合性实验目的和要求：通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。实 验 设 备 及 器 材 ：控温摇床 (37 ) ，高速冷冻离心机，水浴锅，冰箱（-20 , 70）超净工作台，培养箱 (37 ) ，752 分光光度计，灭菌锅等。实 验 原 理 ：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导人细菌

2、的过程。其原理是细菌处于0， CaCl2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的 DNA形成抗 DNA酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42短时间热击处理，促进细胞吸收 DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，r 促使在转化过中获得的新的表型 （如 Amp等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择培养基上。实 验 内 容 ：将质粒载体转移进受体细菌， 需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源 DNA 。将已经转化的细胞在选择培养基上进行筛选。学 生 实 验 报 告 要 求 ：实 验 报 告 要 求 把 每 个 实 验 步 骤 都 进 行 分

3、析 。注 意 事 项 ：无菌操作 低温操作学习好资料 欢迎下载实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验目的 通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。实验原理 将质粒载体转移进受体细菌， 需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源 DNA 。转化 (Transformation)是将外源 DNA 分子引入受体细胞 ,使之获得新的遗传性状的一种手段 ,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 (R ,M ), 它可以容忍外源 DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。

4、为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度 : 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过 监测培养液的 OD600 来控制。DH5 菌株的 OD600 为 0.5 时,细胞密度在 5107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同 ),这时比较合适。密度过高或不足均会影响 转化效率。2. 质粒的质量和浓度 : 1ng 的 cccDNA 即可使 50 l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下 ,DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5。3. 试剂的质量 : 所用的试剂 ,如 CaCl2 等均需是最高纯度的 (GR.或 AR.), 并 用超纯水配制 ,最好分装保

5、存于干燥的冷暗处。4. 防止杂菌和杂 DNA 的污染。本实验以 E.coli DH5a 菌株为受体细胞 ,并用 CaCl2 处理 ,使其处于感受态 ,然后与 pUC19 质粒共保温 ,实现转化。由于pUC19 质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr ) ，可通过 Amp 抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入 pUC19，则在含Amp 的培养基上不能生长。能在Amp 培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了 pUC19。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。一. 仪器控温摇床 (37) 高速冷冻离心机水浴锅冰箱（ -20, 70）超净工作台培养箱 (37)学习好资料

6、欢迎下载752 分光光度计 灭菌锅二. 试剂CaCl2 无菌水 ,冰胰蛋白胨酵母粉Amp NaCl 三. 其他用品移液器，枪头1.5ml ,50ml 离心管三角瓶 500ml 200ml 6cm 平皿 试剂瓶 60ml 量筒 烧杯琼脂 甘油酒精灯 三角玻棒酒精棉球 火柴溶液配制0.1 mol/L CaCl2 溶液 配置 灭菌LB 液体培养基氨苄青霉素（ Amp），用无菌水配制成 50_60 mg/mL 溶液，抽虑灭菌置 20冰箱中保存。四. 材料 E.coli.DH5 质粒 DNA 五: 实验步骤： (CaCl2) （20 人一班，分三组）第一天：从大肠杆菌 DH5 平板上挑取一个单菌落接于

7、2 mL LB 液体培养基的试管中 ,37振荡培过夜。第二天：1. 取 0.5 mL 菌液转接到一个含有 振荡培养50 mL LB 液体培养基锥形瓶中， 3723 h(此时， OD 600 0.4-0.5 ，细胞数务必108mL。此为实验成功的关键 )3. 将菌液转移到 50 mL 离心管中，冰上放置 10 min。4. 离心 10 min（4000r/min）,回收细胞。 4学习好资料 欢迎下载5. 倒出培养液，将管倒置1min 以便培养液流尽。6. 用冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 10 mL 悬浮沉淀，立即放在冰上 30 min。7. 04 6000 r/min,离心 10 mi

8、n，回收细胞。8. 用冰冷的 0.1mol/L CaCl2 2 mL 悬浮细胞，（务必放在冰上）。9. 分装细胞，每 200 L 一份。此细胞为感受态细胞。转化：10. 取 200 L 新鲜制备的感受态细胞， 加入 DNA 2 L（50 ng ）混匀冰上 放置 30 min。同时作两个对照管 受体菌对照： 200 L 感受态细胞 2 L 无菌水 质粒对照： 200 L 0.1 mol/L CaCl2 溶液 2 L 质粒 DNA 溶液 11 .将管放到 42循环水浴 12 min。12. 冰浴 2 min。13. 每管加 800 L LB 液体培养基， 37培养 1 h（慢摇）。14. 将适当体

9、积（ 200 L）已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的 培养皿中。15. 倒置平皿 37培养 1216 h，出现菌落。16.计算转化效率关于大肠杆菌感受态细胞的制备及转化讲解：1、 感受态细胞的概念 重组 DNA 分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，为重组 DNA 分子的转化。这个导入过程及操作统称在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，处于一种感受状态有着很大的关系。所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源另一方面还与受体菌是否DNA 片段并

10、实现其转化的一种生理状态， 它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、 外界环学习好资料 欢迎下载境因子的影响。 cAMP 可以使感受态水平提高一万倍，而 Ca 2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细 胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时， 可加入占总体积 15%的无菌甘油或 -70保 存（有效期 6 个月）。2、 转化的概念及原理 在基因克隆技术中， 转化特指将质粒 DNA 或以其为载体构建的重组 DNA 导 入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体

11、细胞经过一些特殊方法（如：电击法，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源CaCl2等化学试剂法）处理后，DNA 分子通过的感受态细胞。进入细胞的 DNA 分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的 遗传性状。大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2 法），该法最先是由 Cohen 于 1972 年发现的。其原理是细菌处于 0，CaCl2 的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase的羟基 -钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42短时间热冲击处理， 促使细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值， 被转化的细菌中， 重组子

12、中基因得到表达， 在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。Ca 2+处理的感受态细胞， 其转化率一般能达到5 10 62 10 7 转化子 /ug 质粒DNA ，可以满足一般的基因克隆试验。如在 Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如 Mn 2+、Co 2+）、DMSO 或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高1001000倍。化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70保存，因此被广泛用于外源基因的转化。除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA 进入细菌，转化率最高能达到10 910 10转化子/ug

13、 闭环 DNA 。因操作简便，愈来愈为人们所接受。3、 感受态细胞制备及转化中的影响因素学习好资料 欢迎下载、细胞的生长状态和密度最好从 -70或 -20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在 5 10 7个左右为佳。 即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的 OD600 控制。对 TG1 菌株，OD600为 05 时，细胞密度在 5 10 7 个/ml 左右。（应注意 OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统

14、缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。、质粒 DNA 的质量和浓度 用于转化的质粒 DNA 应主要是超螺旋态的，转化率与外源 DNA 的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA 的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5%，1ng 的 cccDNA即可使 50ul 的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于 30kb 的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA 分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质

15、粒高 10100 倍，因此重组 DNA 大都构成环状双螺旋分子。、试剂的质量所用的 CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于 4。、防止杂菌和杂 DNA 的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂 DNA 所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA 的转入。、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。学习好资料 欢迎下载河南科技大学实验教学教案首页实验名称实验二、质粒 DNA 的提取及其酶切实验学时4 每次实验组数6 每组人数5 实验类型

16、验证实验目的和要求：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒 DNA。实 验 设 备 及 器 材 ：微量移液器，微量离心管，常用玻璃器皿，恒温培养箱，恒温摇床，台式离 心机，高压灭菌锅 实 验 原 理 ：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA 与线性染色体 DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。在 pH 值介于 12.012.5 这个狭窄的范围内，线性的DNA 双螺旋结构解开而被变性， 尽管在这样的条件下， 共价闭环质粒 DNA 的氢 键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕， 仍会紧密地结合在一起。 当加入 pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时，共价闭合环状的质粒DNA 的两条互补链仍

17、保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开， 复性就不会那木迅速而准确， 它们缠绕形成网状结构， 通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子 被除去。实 验 内 容 ：用碱裂解法提取质粒 DNA 学 生 实 验 报 告 要 求 ：RNA ，蛋白质 SDS 复合物等一起沉淀下来而分 析 实 验 的 每 一 个 步 骤 。注 意 事 项 ：1、 时 间 要 严 格 控 制 ； 2、 注 意 实 验 所 用 的 温 度 。学习好资料 欢迎下载实验二、质粒 DNA 的提取及其酶切实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA 。实验原理碱裂解法提取质粒是根据共

18、价闭合环状质粒DNA 与线性染色体DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。在 pH 值介于 12.012.5 这个狭窄的范围内，线性的 DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质 粒 DNA 的氢键会被断裂， 但两条互补链彼此相互缠绕， 仍会紧密地结合在一起。当加入 pH4.8 的乙酸钾高盐缓冲液恢复 pH 至中性时，共价闭合环状的质粒 DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体 DNA 的两条互补链彼此已完全分开， 复性就不会那木迅速而准确， 它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA，蛋白质 SDS 复合物等一起沉淀下来而

19、被除去。实验仪器： 微量移液器，微量离心管，常用玻璃器皿，台式高速离心机，分光光度计，恒温培养箱，恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅。试剂及溶液：(1) 用碱法提取质粒 DNA 溶液 1（GET 缓冲液）：50 mmol葡萄糖， 10mmol/L EDTA ，25mmol/LTris.HCI pH 8.o，用前加溶菌酶 4rngmL。溶液 2（变性液）：02 rnoI/I NaOH ，1 SDS。溶液 3（乙酸钾溶液）：60 ml 的 5 molL KAc, 11.5 ml,冰醋酸， 28.5Ml H 2O。（2）缓冲液EcoR 酶解缓冲液（ l 0 ）TBE 缓冲液（I O ）：称取 Tris

20、 108g,硼酸 55g, 0.5moIL, EDTA（pH8.o）40 ml，用 H2o 定容到 l000 ml，高压灭菌作为 l 0 贮液 9 稀释 1 0 倍后作为工作液使用。TE 缓冲液： 1 0 rnmolL Tris HCl， I mmolL EDTA pH 8.o，其中含有 RNase2 0 gmL。（3）上样液及其他试剂 上样液（ 6 ）：0.25溴酚蓝 ,质量浓度 40蔗糖水溶液。溴化乙啶染色液（ 10 rngm t）：在 20ml 水中溶解 0.2g 溴化乙啶，混匀后 4避学习好资料 欢迎下载光保存。异丙醇， 7 0乙醇等。实验步骤（一）提取质粒1. 将 2 ml 含相应抗

21、生素的LB液体培养基加入试管中， 接入上述的含 pUC19质粒的大肠杆菌单菌落， 37振荡培养过夜。2. 取培养物倒入微量1.5ml 离心管中， 4000 r/min 离心 2 min 。3. 弃上清，吸尽残液，使细胞沉淀尽可能干燥。4. 加入 100ul 溶液，充分混匀，室温放置10 min。加 200 ul 溶液 （新鲜配制 ），盖紧管盖，轻轻颠倒数次混匀，将离心管放冰上 5min。5. 加入 150ul 溶液 （ 冰上预冷 ），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置 15min。6. 12000 r/min , 离心 15 min ，将上清转至另一离心管中。7. 加入等体积酚：氯仿（ 1：1

22、）（去蛋白），反复混匀， 12000 r/min ，离心 5 min ，将上清转移到另一离心管中。8. 加入 2 倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置510 min 。12000r/min 离心 5 min 。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。9. 用 1 ml 70% 乙醇洗涤质粒 DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽 干或空气中干燥。10. 加 50 ul TE 缓冲液，其中含有20保存。（二） 酶切20 ug/ml 的胰 RNA酶，使 DNA完全溶解，取 DNA溶液，加酶切缓冲液， EcoRI 酶 1 ul ，无菌水补至总体积 10 ul ，37保温 3h, 加终止液，准备

23、下个实验电泳，分析质粒DNA的限制性酶切图谱。质粒提取的关键问题即质粒提取中三种溶液的作用：碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液 I ，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0 ； 溶液 II ，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液 III ，3 M 醋酸钾 / 2 M 学习好资料欢迎下载醋酸。 让我们先来看看溶液I 的作用。 任何生物化学反应， 首先要控制好溶液的 pH，因此用适当浓度的和适当 pH值的 Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了。那么 50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会

24、快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液 I 中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。 所以说溶液 I 中葡萄糖是可缺的。那么 EDTA呢？大家知道 EDTA是 Ca 2+和 Mg 2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制 DNase的活性， 和抑制微生物生长。在溶液 I 中加入高达 10 mM 的 EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕 DNA会迅速被降解， 因为最终溶解质粒的 TE缓冲液中有 EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液

25、I ，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或 以了。LB培养基来悬浮菌体就可有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。轮到溶液 II 了。这是用新鲜的 0.4 N 的 NaOH和 2的 SDS等体积混合后使用的。要新从浓 NaOH稀释制备 0.4N 的 NaOH，无非是为了保证 NaOH没有吸收空气中的 CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上 NaOH是最佳 的溶解细胞的试剂， 不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer （双层膜）结构向 micelle （微囊）

26、结构的相变化所导致。用了不新鲜的 0.4 N NaOH，即便是有 SDS也无法有效溶解大肠杆菌 （不妨可以自己试一下） ，自然就难高效率抽提得到质粒。 如果只用 SDS当然也能抽提得到少量质粒， 因为 SDS也是碱性的， 只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。 有人不禁要问，既然是 NaOH溶解的细胞，那为什么要加 SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂； 第二，必须温柔混合 （象对待

27、女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。学习好资料 欢迎下载每个人都知道， 溶液 III加入后就会有大量的沉淀， 但大部分人却不明白这沉淀的本质。 最容易产生的误解是， 当 SDS碰到酸性后发生的沉淀。 如果你这样怀疑，往 1%的 SDS溶液中加如 2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II 中不加 SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然 SDS不是遇酸发生的沉淀， 那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在 1的 SDS溶液中慢慢加入 5 N 的 NaCl，你会发现 S

28、DS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了 SDS的沉淀。但如果你加入的不是 NaCl 而是 KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而 PDS是水不溶的， 因此发生了沉淀。 如此看来， 溶液 III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了 SDS中的钠离子形成了不溶性的 PDS，而高浓度的盐， 使得沉淀更完全。大家知道 SDS专门喜欢和蛋白质结合， 平均两个氨基酸上结合一个 SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白

29、质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组 DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组 DNA太长了，长长的 DNA自然容易被 PDS给共沉淀了，尽管 SDS并不与 DNA分子结合。那么 2 M 的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断 DNA，所以要中和之。 基因组 DNA一旦发生断裂， 只要是 50100 kb 大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡， 不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组 DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总 DNA条带。很多人误认为是溶液 III 加入后基因组 DNA无法快速复性就

30、被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物， 与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液 III 加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。不要以为 PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀， 因此要用酚 / 氯仿 / 异戊醇进行抽提， 然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒 DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。这里用2学习好资料 欢迎下载5/24/1 的酚/ 氯仿/ 异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。酚（Phenol

31、）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液 （比如 4M的异硫氰酸胍） ，离心后酚相会跑到上层， 不利于含质粒的水相的回收； 但加入氯仿后可以增加比 重，使得酚 / 氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应） ，因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚 / 氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加，

32、其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。回收后的水相含有足够多的盐， 因此只要加入 2 倍体积的乙醇， 在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。这时候如果放到 20，时间一长反而会导致大量盐的沉淀， 这点不同于普通的 DNA酒精沉淀回收， 所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子，生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用因此 DNA分子之间就容易形成氢键而发 70的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上， 并用 tip 将沉淀打碎， 就能得到好的样品。 得到的质粒样品一 般用含 RNase（50 ug/ml ）的 TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的

33、RNA会干 扰电泳结果的 . 学习好资料 欢迎下载河南科技大学实验教学教案首页实验名称6 实验三、琼脂糖凝胶电泳技术5 实验学时4 每次实验组数每组人数实验类型验证实验目的和要求：通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测实 验 设 备 及 器 材 ：DNA的方法和技术。恒 温 培 养 箱 ，琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 ，台 式 离 心 机 ，高 压 灭 菌 锅 ，紫 外 线 投 射 仪 器 。实 验 原 理 ：DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的

34、净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即 DNA 分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的 DNA 片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA 分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系 .。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的 DNA, 也可以分离相对分子质量相同 ,但构型不同的 DNA 分子。如上次实验提取的 pUC19 质粒，有 3 种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒 DNA(covalently closed circular DNA ，简称CCCDNA) ，开环质粒 DNA ，即共价闭合环状质粒 DNA1 条链断

35、裂，（open circular DNA, 简称 OCDNA ）,线状质粒 DNA ，即共价闭合环状质粒DNA2 条链发生断裂， （linear DNA ，简称 L DNA ）。这 3 种构型的质粒 DNA 分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈 3条带，超螺旋质粒 DNA 泳动最快，其次为线状 DNA ，开环质粒 DNA 。实 验 内 容 ：利 用 电 泳 技 术 分 离 已 经 酶 切 过 的 质 粒 DNA. 学 生 实 验 报 告 要 求 ：要 求 星 期 一 做 完 实 验 后 ， 星 期 五 交 上 ， 实 验 结 果 要 有 图 示 。注 意 事 项 ：1、 注 意 琼 脂

36、糖 的 浓 度 ， 2、 用 溴 化 乙 锭 染 色 时 要 戴 上 手 套 。学习好资料 欢迎下载实验三 琼脂糖凝胶电泳技术实验目的 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的方法和技术。实验原理 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的 pH 溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA 几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA 分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的 DNA 片段泳动速度不一样， 可进行分离。

37、DNA 分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系 .。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的 DNA, 也可以分离相对分子质量相同 ,但构型不同的 DNA 分子。如上次实验提取的 pUC19质粒，有 3 种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA ，简称 CCCDNA) ，开环质粒 DNA ，即共价闭合环状质粒 DNA1 条链断裂，（open circular DNA, 简称 OCDNA ） ,线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA2 条链发生断裂，（linear DNA ，简称 L DNA ）。这 3 种构型的质粒 DNA 分

38、子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3 条带，超螺旋质粒DNA 泳动最快，其次为线状 DNA ，开环质粒 DNA 。 仪器、材料与试剂 一、仪器 1.恒温培养箱 2.琼脂糖凝胶电泳系统 3.台式离心机 4.高压灭菌锅 5.紫外线透射仪 二、材料 1.三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 2.硼酸 3.乙二胺四乙酸 (EDTA) 4.溴酚蓝 5.蔗糖 6.琼脂糖学习好资料 欢迎下载7.溴化乙锭8.DNA marker 实验步骤 (一)制备琼脂糖凝胶电泳槽及用胶量：称取0.3g 琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml0.5 TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化取出摇匀，则为 冷却至 60, 加入适

39、量 EB, 混匀。（二）胶板的制备1%的琼脂糖凝胶液。1. 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘 封好（ 一定封严，不能留缝隙 ）。2. 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。梳子调整齐 3. 将冷到 60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡 ）。4. 待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，将胶槽放在电泳槽内。5. 加入电泳缓冲液至电泳槽中。（三）加样, 用移液器将已加入上样缓冲液的 顺序及点样量 ）。（四）电泳DNA 样品加入样品孔 （记录点样1. 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极， DNA 片段从负

40、极向正极移动）。DNA 的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过 5 V/cm。2. 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿（五）染色12cm 处，停止电泳。将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色以观察在琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作）。问题讨论 1）在细胞内质粒 DNA 是共价闭环 DNA （covalently closed circular DN A ，学习好资料 欢迎下载cccDNA），常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处缺刻，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环 DNA（open circular DNA ，ocDNA ）；若两条链在同一处或其附近断裂，则变成性

41、状 D N A 分子。在电泳时，同一质粒的电泳速度因 DNA 的构型不同而异，其次序为：cccDNA直线 DNA ocDNA ，因此在本次实验中琼脂糖凝胶电泳上的自制质粒呈现 3 条带。如果你不小心在溶液II（实验二）加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是 20-100kb 的大肠杆菌基因组 DNA 的片断。非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有 710 条带，这是由于特殊的 DNA 序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。2）琼脂糖是一种从海藻中提取出来的线状高聚物，当熔化再凝固后就会形成固体基质， 其密度取决于溶液中所含琼脂糖的量。带负电荷的核酸就可以在

42、这种基质中。于电场的作用下向阳极移动。 核酸在琼脂糖基质中的迁移率取决于下列参数： DN A 的分子大小；琼脂糖的浓度；DNA 的构象；所加电压；电场方向；碱基组成与温度；嵌入的染料；电泳缓冲液的组成等。琼脂糖浓度对核酸迁移率的影响是：一定大小的DNA 片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率不同； 在一定浓度的琼脂糖凝胶能够分辨的核酸片段大小范围内，核酸片段的迁移率与其相对分子质量大小相反。3）溴化乙啶的化学名称是3， 8二氨基 r乙基 6 一苯基菲锭溴盐（ 3，S diamino 5 ethyl 6 phenyl phenanthridinium bromide ， 简 称 Ethidium

43、Bromide 或 EB 或 EtBr），由于溴化乙锭分子插入，在紫外光的照射下，琼脂糖凝胶电泳中 DNA 的条带呈现出桔黄色的荧光， 便于检测。EB 能插人 DNA分子中的碱基对之间，完成与DNA 结合（超螺旋 DNA 与 EB 结合能力小于双链闭环，而双链闭环DNA 与 EB 结合能力小于线状双链DNA），DNA 所吸收的260nm 的紫外光（ UV ）传递给 FE，或者结合的 EB 本身在 3O0nm 和 360nm 吸收的射线均在可见光谱的红橙区，以 点：操作简便快速，室温下染色590nm 波长发射出来。 EB 染色具有以下特 15mm20mm；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng 或更

44、少的 DNA 即可检出；可以加到样品中，随时用紫外吸收追踪 检查。但应该特别注意的是，溴化乙啶是诱变剂，配制和使用时应戴乳胶（或一 次性塑料） 手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上。凡是沾污溴化乙啶的学习好资料 欢迎下载器皿或物品，必须经特殊处理后，再进行清洗或弃去。河南科技大学实验教学教案首页实验名称学习好资料欢迎下载实验学时4 实验四植物基因组DNA 的提取每次实验组数6 每组人数5 实验类型验证实验目的和要求：通过本实验学习从植物组织中提取 DNA的方法。实 验 设 备 及 器 材 ：低 温 离 心 机 ，台 式 离 心 机 ，恒 温 水 浴 锅 ，紫 外 分 光 光 度 计 ，液 氮 灌 等 。实 验 原 理 ：利用液氮对植物组织进行研磨， 从而破碎细胞。 细胞提取液中含有的 SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，