实验二：PCR检测apoB基因多态性

1、实验二：PCR检测apoB基因多态性中山医学院生化教研室实验内容1、基因PCR（已完成）；2、鉴定apoB基因PCR产物的DNA凝胶电泳： 1.5%琼脂糖凝胶浓度，100V，1h；1 原理 在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种DNA分子的电荷数、分子量、构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。 DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。3一、DNA琼脂糖凝胶电泳1.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素 1 DNA分子

2、的大小：分子量越大，迁移速度越慢；2 构象：共价闭环DNA分子直线DNA开环双链DNA；3 凝胶浓度：浓度越大，孔径越小，DNA分子迁移越慢；4 电压：电压越高， DNA分子迁移越快；5 缓冲液：碱性环境保证DNA分子带负电荷。1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围琼脂糖浓度（，W/ V ) DNA分子的有效分离范围（kb)0.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-22 实验材料及试剂 琼脂糖 电泳缓冲液：1TAE（Tris acetate-EDTA buffer ） 6加样缓冲液 （溴酚蓝/二甲苯青/甘油） EB染色液（溴化乙锭，ethidium

3、 bromide） 琼脂糖凝胶板的制备（封板、制备1.5%的预染或未染的凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳）将胶置于电泳槽 （注意上样孔位于电泳槽负极一侧）倒缓冲液（没过胶约1mm） 实验步骤上样紫外灯下检测（apoB基因PCR产物：双条带或单条带，700bp左右）取apoB基因PCR产物20 l上样（按学号加样：DNA marker，样品1, 样品2, 样品3, 样品4 ）apoB基因PCR产物电泳（1.5%胶，100V, 1小时）1. 电泳前准备准备内容作用1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净晾干防止不必要的重复污染，减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。2.检查电泳槽，根据情况

4、更换buffer排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录，胶最终越薄越好。实验记录备查2. 制胶步骤注意事项1.称量agarose和bufferBuffer不要用成H2O，称量相对准确2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不

5、均匀影响分离效果。3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一次性倒入。梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔的体积能点的下所有的样。用枪头赶掉气泡。制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产生。EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低，染色成像不明显；不宜过高，导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜

6、过短，影响胶内部孔径形成。5.拔梳子，放入电泳槽。缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。3. 上样电泳步骤注意事项1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X，混匀Loading buffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。2.点样（每孔10ul）apoB基因PCR产物电泳（1.5%胶，60v， 2小时）沿着胶孔的边缘匀速加入。尽量避免碰坏胶孔。枪头不要吸过多的气泡，拔起时不要过猛带出样品。每点一个样完，吸取buffer洗枪头，避免

7、样品混杂。如果是有特殊要求，例如回收，强烈建议每点一个样换一次枪头。加样的速度当然是越快越好，注意保证质量。点样的量不要太大，一方面是体积不要太大，溢出污染邻位样品；一方面不量要太大，容易导致脱尾和模糊不清。3.接通电源，选择合适的电压和时间电泳。胶孔与电极成水平状态，防止样品跑歪。跑胶期间不时回来看看，防止样品跑出胶等意外发生。4. 染色成像步骤注意事项1.染色如果胶中没有加入EB，用0.5ug/ml的EB溶液浸染5-10分钟。2.调整镜头的拍摄范围和焦距，成像3.打印照片做分析记录又称无细胞克隆技术(“free bacteria” cloning technique)，是一种对特定的DNA

8、片段在体外进行快速扩增的方法。该方法一改传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，操作简便，在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增107108倍，大大提高了DNA的得率。因此，现已广泛应用到分子生物学研究的各个领域。 二、聚合酶链反应或多聚酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）Kary MullisPCR技术最早由美国 Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的；Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学奖。 （一）原理PCR是在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况

9、下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程分三步。变性：加热，模板DNA形成两条单链退火：降温，模板单链DNA与引物配对 结合延伸：在DNA聚合酶及镁离子等存在的 条件下，引物3端向前延伸，合 成与模板配对的新链PCR由上述高温变性、低温退火及适当温度延伸等几步反应组成一个周期，循环进行后使目的DNA得以迅速扩增。5335（二）PCR反应体系的组成及功能 PCR的完成是在一个0.5ml的EP管中完成，一个完整的PCR反应体系应包括以下成分： 1. 引物 2.模板DNA 3. Taq DNA聚合酶 4. dNTP 5. 10PCR反应buffer（含镁离子）1、引物：人工合成短寡核苷酸是预

10、扩增DNA片段两端的已知序列，是保证PCR特异性的关键因素，目的是提高扩增的效率与特异性。终浓度为0.10.5umol/L，浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。 设计原则：（1）引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。（2）引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。（3）引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 （4） 避免引物内部

11、出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的 互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。Primer 本身不要出现内部互补序列, 形成内部loop环二级结构, 如：GGGTCGATTCCTACCCATGC注意减少Primer间互补序列,导致2个Primer形成dimer , 一般不要超过 3个互补bp 如：CCCATGC ATGGAGTC : : : : : : : : GGGTCTA TCAGTAAGC （5） 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 （6）引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 修

12、饰： 如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果 突变： AGCTCCATGACCCAG 5CGCTCCATGACCCAG 3 注意：绝不可以在3端进行上述改造 DNA聚合酶是53聚合，若3端改造不能互补不能延伸 （7） Primer 5未端可修饰、突变: （8） primer 5端增加碱基: 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 内切酶识别点： （G）GAATTC GCTCCATGACCCAG 保护bp 对PCR产物cloning有很大好处 ATG起始密码 TAA、TAG、TGA终止密码如：可溶性受体的表达，无膜内区、穿膜区，只有

13、膜外区。 引物设计软件Primer Premier 5.0 （自动搜索）* Oligo 6 （引物评价） Vector NTI Suit DNAsis Omiga DNAstar Primer 3 （在线服务） 2. Taq DNA聚合酶水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶，其特点有： 53DNA聚合酶活性； 无35外切酶活性，因此无校正功能； 有良好的热稳定性， 最适聚合酶 温度72，选择72延伸； 半衰期： 92.5 130min 95 40min 97.5 56min 变性温度95，使其在整个扩增循环中保持足够活性； 其活性对Mg2+浓度非常敏感； 终浓

14、度一般为：2.5U/100ul； 3. 模板DNA （1）模板用量 Plasmid:1ng, Chromosome:300-500 ng, 一般认为102104拷贝模板就可以满足要求。 （2）可选DNA 质粒、 噬菌体、染色体DNA 注意： 防止交叉污染4. dNTP （1）四种脱氧核苷酸，基本原料,四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应 （2）已有商品化的混合液，终浓度一般为20-200umol/L,高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。 注意：不稳定，保存时间长会失效5. 10PCR反应buff

15、er (1) 250500mmol/L KCl； (2) 100500mmol/LTris-HAC (pH8.4)； (3) 1520mmol/L MgCl2（对Taq酶的活性影响很大，一般浓度为1.52.0mmol/L，实际应用时根据反应体系的情况进行调整）； (4) 0.1%明胶或牛血清白蛋白Mg2+ (1)TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+ (2)不同的酶需不同Mg2+ (3) Taq：Mg2+ 对反应影响很大，1-3 mM终浓度外界影响： (1) EDTA鳌合Mg2+ 选较低浓度TE(10mM Tris,1mM EDTA)； (2) DNA模板、引物和dNTP 的磷酸基团均可与Mg2

16、+ 结合， 降低Mg2+有效浓度 如果扩增产物或效率不理想，要注意调整Mg2+浓度（三） PCR反应条件PCR循环的温度和时间（变性、退火、延伸） PCR循环的次数和平台效应 （1）变性温度：94-95 Templete：GC比例高、长度很长，则变性时间 （2）退火：温度越高，扩增特异性越好 取决于引物Tm值：Tm值=4(G+C) 2(A+T) ； 复性温度=Tm值-(510) ，一般在4555 ； Tm退火T，Tm退火T ； 若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度（3) 延伸：72 1min/kb（10kb内） 一般：4060sec 温度和时间平台效应PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增

17、量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y(1X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，引物、底物的消耗、 DNA聚合酶活性下降及非特异性产物的竟争等因素，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，大多数情 况下，平台期(Plateau phase )的到来是不可避免的。 Plateau phase in PCR apoB基因PCR反应体系和反应步骤体系25 l Mix1

18、2.5 l 引物2 l ddH2O6.5 l 模板4 l 步骤温度时间预变性94 5 min变性94 1 min退火+延伸60 4 min延伸60 10 min35 cycles循环数（四） PCR 的特点操作简单省时：1-2 hr灵敏度高：pg特异性强对原始材料质量要求低有一定程度的单核苷酸错误掺入适用于克隆序列清楚的基因（五） PCR的应用1遗传病的产前诊断：如地中海贫血、镰刀状细胞贫血、凝血因子缺乏；2致病病原体的检测 ：对于难于培养的病毒（乙肝），细菌（如结核、厌氧菌）和原虫（如梅毒螺旋体）等来说尤为适用。；3癌基因的检测和诊断：白血病残留细胞的定量（包括慢粒和急粒），肺癌中P53及R

19、b等抗癌基因的失活，神经质瘤N-myc基因的激活和表达；4DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证：肌红蛋白小卫星基因，-珠蛋白基因、ApoB基因等的多肽性和重复次数的差异都被应用于鉴定，骨髓或脏器移植配型及动物种系的研究 ；5动、植物检疫：检查出入国门的人员、动、植物（种畜、种籽）等是否携带烈性传染病（艾滋、动物病毒、植物病毒等）病原体，食品、饲料等是否带沙门氏菌等 ；6高科技生物医学领域中的应用在转基因动植物中检查植入基因的存在。7. PCR技术尚可应用于基因拼接、测序等领域。 参考书目PCR技术实验指南 黄培堂 等译，1998年6月第一版，科学出版社PCR技术实验指南（第二版）（影印

20、），Carl W. Dieffenbach, Gabriela S. Dveksler，2003，Cold Spring Harbor Lab(CSHL) Press，科学出版社PCR传奇一个生物技术的故事，保罗 拉比诺 潘涛 等著，朱玉贤译，1998-12第一版，上海科技教育出版社 三、基因多态性 (genetic polymorphism)基因多态性（polymorphism）是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型（genotype）或等位基因（allele）。从本质上来讲，多态性的产生在于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功

21、能的区域。对于一个体而言，基因多态性碱基顺序终生不变，并按孟德尔规律世代相传。1 基因多态性产生的原因单个核苷酸的点突变即核苷酸的替换单一DNA序列的插入或缺失整串DNA序列的插入或缺失基因转换2 基因多态性类型的检测 （1）限制性片段长度多态性(RFLP)标记：由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA区段发生突变引起的。（2）随机扩增多态性(RAPD)标记：RAPD是通过短的随机引物扩增个体基 因组DNA体现多态性。 （3）扩增片段长度(AFLP)多态性标记：AFLP是将PCR技术与RFLP结合的一种方法，通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩增来检测DNA酶切片段长度的多态性。 （4）微卫星多态性标记(SSRP)：基于PCR技术的DNA标记，多态性是由同一座位上的串联单元数量的不同而产生的。 （5）单链构象多态性标记(SSCP) （6）单核苷酸多态性标记(SNP)：将被测DNA片段与高密度DNA探针(中部单核苷酸 替代探针)微阵列杂交，一次性快速显示被测序列的单核苷酸多态性，