抗体制备问答

1、一、抗原多肽选择的基本原则1、尽可能是在蛋白表面2、保证该段序列不形成ahelix3、N,C端的肽段比中间的肽段更好4、避免蛋白内部重复或接近重复段的序列5、避免同源性太强的肽段6、交联可以交联在N，C两端，选择依据就是交联在对产生抗体不太重要的一端7、序列中不能有太多的Pro,但有一两个Pro有好处，可以使肽链结构相对稳定一些，对产生特异性抗体有益。二、抗原多肽设计的基本原则为了使生产抗体获得最佳效果，仔细地设计抗原多肽是很有必要的，设计应满足一个基本条件：在免疫过程中，该抗原既不会产生过强的免疫反应，同时又能产生出对感兴趣的蛋白有结合能力的抗体。尽管抗原设计是一个很复杂的课题，有诸多需要注

2、意的细节，已超过了我们所能提供的范围，根据我们所积累的经验，有几点关键的基本设计原则可以提供给大家参考：1、确定抗体的用途（应用）新开展一个研究项目，弄清楚所感兴趣的蛋白的一些基本特性是很有必要的，特别是如果知道蛋白的结构会对选择抗体易于接触和识别的识别区域有很大的帮助。然而，在没有这样精确的结构信息（多数是这种情况）的情况下，了解研究的用途（应用）会影响多肽设计的策略。例如：如果研究重点是集中在蛋白的不同区域，如C端或N端，或在一种特定状态下的蛋白，如磷酸化等，那么按照所需序列设计的多肽和产生的相应的抗体在应用上应该没有太大的困难，然而，蛋白的构象将影响抗体与其识别区域之间的相互作用。这种情

3、况下可能存在的问题是如果在折叠的蛋白中，该识别区域被藏在蛋白的内部，抗体将无法接触到该区域。（无法产生相互作用）。2、识别区域的选择原则一般说来最理想的抗原性识别区域应具备亲水、位于蛋白表面和结构上易变形性等特点。因为在大多数的天然（自然）环境中，亲水区域倾向于集中在蛋白表面，而疏水区域常常被包裹在蛋白内部，同样道理，抗体只能与在蛋白表面发现的识别区域相互作用，而当这些识别区域有足够的结构易变形性而转移到抗体可接触的位置时，将会与抗体间有很高的亲和性。3、连续的与不连续的识别区域连续的区域是指由连续的氨基酸序列（残基）构成的识别区域。大多数抗体是针对连续识别区域的，抗体能与这类区域以很高的亲和

4、力相结合表明这段序列不在蛋白内部。不连续的识别区域是代表有一定折叠的一段多肽序列，或是将两段分离开的多肽连在一起的抗体的识别区域。在某些情况下，针对这样不连续识别区域的抗体也能产生，只是用来免疫的抗原多肽必须具备与该不连续识别区域相似的二级结构，而序列的长度需要符合相关的要求。4、基本建议为了避免识别区域隐藏在蛋白内部的风险，我们通常建议选择蛋白的N,C两端来产生的相应的抗体。因为在完整的蛋白中，N，C两端通常是暴露在蛋白表面的。然而，一定要注意膜蛋白的C端疏水性太强，不适合作为抗原。5、序列的长度通常我们建议抗原多肽的序列长度在8-20个氨基酸残基之间，如果太短，就有多肽太特殊、所产生的抗体

5、与天然蛋白之间的亲和力（结合能力）不够强的风险，同样，如果序列长度超过20，将有可能引入二级结构，所产生的抗体失去特异性的可能，而且肽链越长，通常合成难度增大，不易获得高纯度的产品。6、载体蛋白交联的选择基本原则：将载体蛋白加在远离抗体识别区域的一端，在序列中没有Cys的情况下在N或C端加上Cys为交联的首选方法。7、常用分析软件MacVecforTM;DNAstarTM;PC-GeneTM多肽合成的常见问题（一）问：多肽的两端应如何处理？是保持自由状态还是屏蔽起来？答：多肽是用来模拟蛋白的，为了模仿蛋白的表现，我们需要合成与蛋白有相似的结构和电荷的多肽。当一条肽段从一个蛋白中“切出”之后，两

6、端的电荷数将与基因体蛋白有差异。我们需要改变合成策略来使他们一致。总体而言：如果是出自蛋白C端的序列，通过乙酰化将N端屏蔽；如果是出自蛋白N端的序列，通过酰胺化将C端屏蔽；如果是出自蛋白中间部分，用乙酰化和酰胺化将两端都屏蔽。多肽合成的常见问题（二）问：如果我的肽纯度是95%，那么，其余的5%都是些什么物质？答：多肽的纯度通常是通过HPLC，用每分钟1%的标准乙晴梯度来检测决定的。合成过程中，氨基酸之间的交联效率不是总能达到100%，因而产生一系列的氨基酸缺失的杂质。大多数这样的氨基酸缺失的杂质在纯化过程中都被去掉了，但有少数的杂质其色谱表现与目标多肽很相近。这些氨基酸缺失的杂质肽留在了多肽样

7、品中就构成了余下的几个百分多肽合成的常见问题（三）问：如何重新溶解多肽？答：多肽的溶解与多肽的序列相关，首先试蒸馏水和超声（1-10MG/ML）,如果不溶，计算肽中的碱性残基（Lys,Arg,His和自由氨基端）和酸性残基（Gly,Asp和自由羧基端）的数目。如果碱性基团偏多，可以滴加1N的醋酸，直到溶解为止，如果酸性基团居多，滴加1N的氨水，直到溶解为止。如果在实验中需要用缓冲液，建议在多肽完全溶解之前不要加入盐，因为盐会使肽的溶解度降低。如果上述溶液中肽都不溶，可以试试用少量有机溶剂如DMSO，乙晴或DMF。多肽合成的常见问题（四）问：什么是多肽的净含量，它的意义是什么？答：干品多肽的重量

8、中不仅仅包含多肽，还包含有一些非肽的组份，如水，被吸收的溶剂、配位离子和盐等。肽的净含量是指肽在其中的重量百分比，这个百分比的数值范围很大，可能从50%到90%，取决于纯度、序列以及合成和纯化的方法，不要将肽的净含量和肽的纯度混为一谈，它们是完全不同的两个概念。纯度通常是由HPLC决定的。纯度定义的是多肽样品中含正确序列的组分的百分比，而肽的净含量是指样品中肽类物质相对于非肽类物质所占的百分比，肽的净含量通常是用氨基酸组分分析或紫外分光法测定的。这个信息主要是在一些对肽的浓度很敏感的实验中，对计算肽的浓度是很重要的。多肽合成的常见问题（五）问：对不同的实验，如何选择肽的纯度？答：肽的纯度是很重

9、要的指标，纯度的选择取决于实验的目的。对不太灵敏的筛选实验，建议使用粗品或75%，对免疫级别，建议选用85%。对于受体与LIGAND相互作用的研究，生物ASSAY研究，或细胞水平的研究，建议95%，对于结构研究，建议98%。多肽合成的常见问题（六）问：如何保存多肽？答：在可能的情况下，应该尽量将多肽以冻干粉的形式在-20C下保存，这样会在几年内避免细菌的降解，二级结构的形成、氧化或其他修饰的发生。多肽在溶液中的稳定性要差一些，所以强烈建议使用灭菌水或灭菌过滤的方式进行溶解，如果序列中有Cys,Met或Trp等残基，用无氧的溶剂进行溶解以避免氧化。使用冷冻的溶液时，建议将溶液进行分装，以避免多次

10、的溶解和冷冻对多肽造成的损害。pH的推荐范围是3-6之间。使用前应保证包装容器和所装物品回温到室温，以避免吸水。多肽溶液最好即配即用，使用过程中将肽溶液保持在低温但不结冻的状态下。长期保存（3个月到5年）：冻干粉，在-20C下冷冻干燥保存；中期保存（0-3个月）：-20C冷冻液体或冻干粉冷藏；短期保存（1周）：冷藏的液体或冻干粉。多肽合成的常见问题（七）问：你们用什么方法生产多肽？答：线性多肽肽链的延伸采用Fmoc固相合成法，由C端到N端逐步依次将氨基酸连接上。开始，将第一个氨基酸通过一段对酸敏感的连接物连接在不溶性的支撑物树脂上。用六氢吡啶将Fmoc保护基去掉后，第二个Fmoc保护的氨基酸被

11、连接了上去，连接方法有预活化或“一锅煮”等。目标序列连接完毕后，用TFA将肽链从树脂上洗脱得到粗品。载体蛋白交联的相关问题（一）问：为什么需要将多肽与载体蛋白交联？答：对在动物体内产生免疫反应而言，大多数多肽的分子量都太小。将多肽与载体蛋白如KLH等交联之后，不仅能增加抗原的大小，也能增强免疫性。我们可以提供与KLH和BSA两种蛋白的交联。大多数客户选择与KLH交联，因为KLH的免疫性更好，而且BSA在很多实验中作为Blocking试剂，由于动物体内既会产生对多肽的抗体也会产生对载体蛋白的抗体，这样会出现假阳性。载体蛋白交联的相关问题（二）问：为什么要使用抗体？答：由于抗体与很多生物分子，以蛋

12、白和多肽等尤为著称，有很强的结合能力，抗体在生物医学研究中占据独特的重要地位，在对蛋白的特性、含量的测定、分布情况的分析和蛋白的确证等方面都需要用到抗体。例如：诊断试剂盒类似于怀孕检查等、蛋白microalloy，immunohistochemistry和普通的ELISA实验等。由于抗体有对特定分子很强的结合能力的特点，用抗体进行体内治疗成了许多努力的方向。成功的范例包括Genetech的Herceptin，用于治疗一类特殊的乳腺癌和IDEC药业公司的Ritaxan，用于特定类型的Mon-HodgkinsLymphomasB细胞。载体蛋白交联的相关问题（三）问：什么是抗原和识别区域？答：大多数

13、情况下antigen和immunogen两个字是可以互换使用的，他们的差别是很小的。他们是分别指一个分子与免疫系统之间的两种类型的相互作用。一个immunogen是指能使一个生物组织的免疫系统产生免疫反应的分子,而一个antigen是指能与这种免疫反应的产物结合的分子，所以immunogen一定是antigen，但antigen不一定是immunogen，我们这里通用antigen，特指能与免疫反应的产物一抗体结合的分子。识别区域（epitopes）是指一个抗原分子中一个与抗体直接结合的一段特定的序列，对于任何抗原，（抗原蛋白），很有可能有多个抗体识别区域，对生产抗体而言，易于抗体识别的部位的

14、识别区域最为理想。载体蛋白交联的相关问题（四）问：对抗原多肽什么样的肽链长度比较合适？答：通常建议10-15个残基。肽链越长，抗体识别的区域越多，但也就越多机会形成稳定的二级结构。就不再是天然的形式了。太短的肽通常是没有用的，除非有充足的理由，如与相关家族蛋白或其他蛋白有序列同源性等。载体蛋白交联的相关问题（五）问：你们通常用什么化学方法进行KLH交联？答：我们用MBS活化KLH，这样能将载体蛋白（KLH）上面的自由-SH与多肽末端的Cys的侧链-SH连接起来，这种方法直接，特异性高，而且稳定，通常选择对免疫不重要的一端进行交联。EDC活化载体上的-COOH，将载体的-COOH和多肽的-NH2

15、连接起来也是一种可行的方法。但我们只建议在多肽序列中有多个Cys时采用该方法。但如果肽链中含有多个-COOH或-NH2基因，不建议使用该方法，因为会造成多重点交联的情况，使多肽结构受影响。常用载体蛋白除KLH外，还有BSA，Ovalbumin等，造成KLH的优势是它不干扰ELISA或WesternBlot等实验。载体蛋白交联的相关问题（六）问：为什么我的KLH交联多肽溶液呈乳状？答：KLH是一个很大的并且聚合的蛋白。因为它的结构和大小，它在水中的溶解度是很有限的，因此是乳状，这并不影响它的免疫性，这种混浊的溶液可以直接免疫动物。载体蛋白交联的相关问题（七）问：我能得到多少抗体？答：抗体的产量取

16、决于很多因素：识别区域的选择，多肽的合成，载体的交联，免疫的操作步骤和动物的生理系统等等，因此抗体的产量是不等的。5-25MG都属于正常范围。抗血清制备的方法动物免疫（1）问：可选用何种动物用来免疫？其注意事项有哪些？答：作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡

17、的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以23kg为宜。问：通过何种途径进行免疫？答：免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。抗血清制备的方法动物免疫（2）问：免疫时为什么要加入佐剂？常用的佐剂有哪几种？如何配制？答：由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫

18、佐剂。佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。常用的佐剂是福氏佐剂（Freundadjuvant），其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：29（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入120mg卡介苗就成为完全佐剂。配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4C下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐

19、剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗34mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上510min内完全不扩散为止。为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用抗血清制备的方法动物免疫（3）问：如何进行免疫？其剂量及过程如何？答：抗原剂量，首次剂量为300500g加强免疫的剂量约为首次剂量为1/4左右。每23周加强免疫一次。加强免疫时用不完全佐剂，首次免疫时皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加强免疫时不必注射百日咳疫苗。在第2次加强免疫后2周，从

20、耳缘静脉取23ml血，制备血清，检测抗体效价（见后）。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止（图2-3）。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。抗血清制备的方法（4）血清的采集与保存问：如何采集和保存抗血清？答：家兔是最常用以产生抗体的动物，因此这里主要讨论兔血的收集。羊等较大动物以颈静脉、动脉取血鼠等小动物取血可参阅有关资料。取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉入血，也可心脏采血。取动脉或静脉放血时，将兔放入一个特造的木匣或笼内，耳露于箱（笼）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳缘的毛，用少许二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管扩张、充血。用手轻拉耳尖，以单面剃

21、须刀或尖的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即流出，每次可收集3040ml。然后用棉球压迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反复多次放血。颈动脉放血时，将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。放血过程中要严格按无菌要求进行。收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4C下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，分装（0.050.2ml）,贮于-40C以下冰箱，或冻干后贮存于4。C冰箱保存。抗血清制备的方法（5）影响因素问：免疫失败的可能原因有哪些？应采取哪些对应措施？答：有时不能获得满意的抗血清，可从

22、下列几方面找原因，并改进之。（1）免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。（2）抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。（3）制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。（4）所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化。（5）免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。（6）动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。抗体纯化盐

23、析法纯化免疫球蛋白（1）（一）原理蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。（二）影响盐析的因素蛋白质的浓度：盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随I之增加，从而影响蛋白质的纯化。故常将血

24、清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。离子强度:各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50%时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33%时y球蛋白析出。盐的性质：最有效的盐是多电荷阴离子。PH值：一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。温度：盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。血清蛋白于25C时较0C更易析出。但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。蛋白质沉淀后宜在4C放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。抗体纯化盐析法纯化免疫球蛋白（2）操作步骤取正常人混合血清加等

25、量生理盐水，于搅拌下逐滴加入与稀释血清等量的饱和硫酸铵终浓度为50%饱和（NH4）2SO4J4C,3小时以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20分钟，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至Xml。再逐滴加饱和硫酸铵X/2mlJ置4C，3小时以上此时（NH4）2SO4的饱和度为33%）重复上述第二步过程1?次。将末次离心后所得沉淀物以0.02MPH7.4PBS溶解至Xml装入透析袋。|对PBS充分透析、除盐换液3次，J至萘氏试剂测透析外液为无黄色将透析袋内样品取少许作适当倍数稀释后，以751-G紫外分光光计测蛋白含量。方法如下:蛋白含量（mg/ml）=（1.45x0D280nm-0.74x0D260

26、nm）x样品稀释度。注：式中1.45与0.74为常数，nm为波长。抗体纯化一亲和柱层析纯化IgG及IgG亚类（1）（一）原理葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。利用改变PH及离子强度可洗脱结合于SPA-SepharoseCL-4B柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。（二）注意事项SPA-SepharoseCL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用1020次左右。方法:先用10倍柱体积0.1MPH8.5Tris含0.5MNaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1MPH4.5醋酸钠

27、缓冲液含0.5MNaCl液洗脱柱上残存的杂蛋白；0.1MPH8.0磷酸缓冲液平衡，4C贮存。SPA-SepharoseCL-4B亲和层析法还可用于:（1）除去抗体液中IgG，检测非IgG抗体（如IgM）的生物学活性；（2）除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段；（3）回收或纯化免疫复合物。狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。抗体纯化一亲和柱层析纯化IgG及IgG亚类（2）（三）操作步骤用0.1MPH8.0磷酸缓冲液浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝胶，15min。按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶（用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤）装

28、柱后用0.1MPH8.0磷酸缓冲液平衡I标本可用硫酸铵粗提物，先10,000g离心除去杂质，必要时用0.22gm滤膜过滤。上样前用1MPH9.0Tris液调整标本液PH至8.1或对平衡液透析过夜I加样，一般按2530mgIgG/g湿胶比例加样，室温作用15min,0.1MPH8.0磷酸缓冲液充分淋洗至淋洗液OD值为0.02。I用不同PH的枸椽酸洗脱液洗脱，流速20ml/ho如纯化小鼠IgG1一般用PH6.0；纯化IgG2a用PH4.0；纯化IgG2b用0.1MPH3.0醋酸盐缓冲液或0.1MPH3.0Glycine-HCl缓冲液洗脱。I用PH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中

29、和含有IgG的洗脱液I收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定抗体检测与应用的方法选择与步骤(一)ELISA检测免疫印迹(Westernblot)免疫沉淀(Immunoprecipatation)ELISA的应用ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本，因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学