核酸分子杂交(1)讲解课件

1、分子生物学 Molecular Biology核酸的分子杂交Nucleic Acid HybridizationDepartment of biochemistry and molecular biology1 碱基 核苷 核苷酸RNA 腺嘌呤（A） 腺苷 腺苷酸(AMP) 鸟嘌呤（G） 鸟苷 鸟苷酸(GMP) 胞嘧啶（C） 胞苷 胞苷酸(CMP) 尿嘧啶（U） 尿苷 尿苷酸(UMP)DNA 腺嘌呤（A） 脱氧腺苷 脱氧腺苷酸(dAMP) 鸟嘌呤（G） 脱氧鸟苷 脱氧鸟苷酸(dGMP) 胞嘧啶（C） 脱氧胞苷 脱氧胞苷酸(dCMP) 胸腺嘧啶（T） 脱氧胸苷 脱氧胸苷酸(dTMP)DNA和RN

2、A的碱基核苷和相应的核苷酸2核苷酸之间连接3 DNA双螺旋结构4Base pairing occurs in duplex DNA and also in intra- and inter-molecular interactions in single-stranded RNA (or DNA). 5Content of Table一、核酸分子杂交技术的原理二、核酸探针的制备三、核酸探针的标记四、核酸分子杂交技术五、DNA芯片技术6一、核酸分子杂交技术的原理 有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。 如把一段已知基因（DNA或RNA）的核酸序列

3、用合适的标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作探针（probe), 与变性后的单链基因组DNA或RNA等进行杂交。 用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列的拷贝数及表达丰度等。 789DNA变性是指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链，从而使核酸的天然构象和性质发生改变。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。 10溶液粘度降低。DNA双螺旋是紧密的刚性结构，变性后代之以柔软而松散的无

4、规则单股线性结构，DNA粘度因此而明显下降。溶液旋光性发生改变。变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构性改变，使DNA溶液的旋光性发生变化。 增色效应。指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。 11复性指变性DNA 在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为 退火(annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成。DNA的复性不仅受温度影响,还受DNA自身特

5、性等其它因素的影响。 12 应 用：1）检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；2）用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。 13影响杂交的因素核酸分子的浓度和长度温度离子强度杂交液中的甲酰胺核酸分子的复杂性非特异性杂交反应14 1、核酸分子的浓度和长度： 浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.10.5g，浓度 过高影响杂交效率152、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低 2025 （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺 降低Tm值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm 值低

6、5 163、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度 174、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在3542 杂交 （2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68杂交 185、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度 （2）Cot与反应体系中核酸复杂性成正比 （3）两个DNA样品浓度绝对一

7、致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性 196、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉20常用于预杂交的封闭物变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用小牛血清白蛋

8、白。Home21二、核酸探针的制备探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。22理想的探针1.要加以标记、带有示踪物，便于杂交后检测和鉴定杂交分子。2.应是单链，若为双链用前需要先行变性为单链。3.具有高度特异性，只与靶核酸序列杂交，不与样本中存在的其它核酸杂交。4.探针长度一般是十几个碱基不等，小片段探针较大片段探针杂交速率快。5.作为探针的核苷酸序列要选取基因编码序列，避免用内含子及其它非编码序列。6.标记的探针应具有高灵敏度、稳定，标记方法简便、安全。23(一）探针的分类据制备方法及核酸性质不同，可分为： 基因组DNA探针（genomic p

9、robe） cDNA探针（cDNA probe） RNA探针（RNA probe） 寡核苷酸探针（oligonucleotide probe)据探针标记物的类型不同：同位素标记的探针非同位素标记的探针241、 Genomic probe 从基因组文库中筛选和纯化获得的一个特定基因（或基因片段）的克隆片段。多为某一基因的全部或部分序列（含有内含子序列），或某一非编码序列，或某一外显子序列。25这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，P

10、CR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。 特点：26 cDNA（complementary DNA）是指互补于mRNA的DNA分子。 这种DNA探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基因表达的检测。2、 cDNA probe27 采用基因克隆或体外转录的方法获得。有些病毒的基因组是RNA，分离后经适当标记可制成RNA探针。3、 RNA probe28RNA探针优势杂交的效率高，杂交体较稳定。RNA中不存在高度重复序列，因此非特异性杂交较少。杂交后RNase将未杂交的探针分子消化掉，使本底降低。29 寡核苷酸探针是采用DNA合成仪人工合成的，与已知基因DNA互补的，长度可从十几到几十个核苷酸的片

11、段。一般长度为 2050 个碱基。 亦可根据蛋白质氨基酸序列推导出核酸顺序加以人工合成。4、oligonucleotide probe30探针的制备方法探针长度一般以50300bp为宜。 制备方法：1）利用DNA重组技术（基因组DNA探针制备）2）PCR扩增（cDNA探针制备）3）化学合成（寡核苷酸探针制备）31制备基因组文库细胞DNA酶切重组DNA筛选获目的基因转化细菌，培养存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称为基因组DNA文库（genomic DNA library) 。制备探针时，增殖细菌，扩增、提取质粒，用限制酶切，回收特定基因片段，经标记则成为基因组DNA探针

12、。32Construction of a Human Genomic Library33Restriction Enzyme - Action of EcoRI 34DNA recombination35cDNA 探针制备逆转录合成cDNA分离纯化mRNA PCR扩增36 根据已知的核酸顺序，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段或根据蛋白质氨基酸序列推导出核酸顺序加以人工合成。化学合成（寡核苷酸探针制备）Genetic code37合成寡核苷酸探针注意原则：1）长度（18-50 bp); 2）G:C对含量40%-60%；3）探针内避免互补；4）避免同一碱基连续出现；5）与非靶序列有70%

13、以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。Home38三、核酸探针的标记 为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。39（一）标记物 1、理想标记物应具备的特性：1）标记前后探针的基本结构、化学性质相同;2）特异性强、本底低、重复性好；3）操作简单、节时；4）安全、无环境污染。40放射性核素非放射性标记主要有：32P、35S、3H、125I、131I等。优点：灵敏度和特异性极高，可检出样 品中少于1000个分子的核酸量。缺点：半衰期短，稳定性差，污染环 境、检测需时较长。主要有：生物素、地高辛、辣根过氧 化物酶，碱性磷酸酶及FITC等。优

14、点： 具有稳定、安全、经济及实验周期短等特点，近年来应用越来越广泛。缺点：灵敏度低于放射性核素标记的探针2、标记的种类41（二）探针的标记方法放射性同位素标记法缺口平移法(Nick translation)随机引物延伸法(Random primer labelling)末端标记法(End labelling)非放射性同位素标记法酶促标记法、化学标记法42缺口平移法的原理 将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的53聚合酶活性和5 3外切酶活性相结合。DNAase I 在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于E.coli的DNA pol I的53外切酶活性，切

15、去带有5-磷酸的核苷酸；同时利用该酶53聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 这两种活性同时作用，缺口不断向3方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。 43切口移位（平移）法444546随机引物标记法原理 用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3- OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。474849末端标记法原理（1）一种是在5末端加成标记法： 先用碱性磷酸酶（AP）

16、去掉dsDNA 5-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP转移加到DNA片段5-OH上。（2）在探针3-末端用末端转移酶掺入一个单标记的ddUTP。50末端标记法5152非放射性同位素标记法光敏生物素标记核酸 由一个光敏基团、一个连接臂和一个生物素基团组成。光生物素的光敏基团是-N3，它在光作用下可与核酸中的碱基结合。酶促标记法将标记物预先标记在核苷酸分子上，利用酶促聚合反应将其掺入到待标记的探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基团交换到核酸分子上。 53探针的纯化1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和

17、小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-503、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针5455核酸分子杂交信号的检测放射性同位素标记探针： 放射自显影。 非放射性同位素标记探针： 偶联反应+显色反应。56放射自显影 通过X光片检测放射性核素标记物。其基本原理为：同位素在不断衰变过程中释放出-粒子，粒子撞击X光片感光层，形成潜在影象，经过显影即可见到成像。571偶联反应 可以通过抗原-抗体免疫反应系统与显色体系偶联。地高辛系类固醇半抗原化合物，地高辛标记探针杂交信

18、号可通过酶联免疫法与抗地高辛抗体和碱性磷酸酶的复合物结合，再进行酶促显色反应。2显色反应（1）酶促显色法：最常用的酶是碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶（2）荧光法：荧光素探针主要用于原位杂交，最常用的为FITC。 （3）化学发光法：化学发光指在化学反应过程中伴随的发光反 应。化学法检测5859地高辛标记探针杂交信号检测Home60四、核酸分子杂交技术 核酸分子杂交 固相杂交 液相杂交 印迹杂交 原位杂交固相杂交：结合于某种固相支持物上的待测样品与溶解于杂交液中的探针进行的杂交。包括膜上印迹杂交、原位杂交。液相杂交：待测样品和探针均溶于液体中进行杂交反应。61菌落杂交(Colony in situ h

19、ybridization)常用的固相杂交类型Southern印迹杂交(Southern blotting) 原位杂交(in situ hybridization)其他类型杂交（Other hybridization)斑点杂交(Dot blotting)Northern印迹杂交(Northern blotting)62核酸分子杂交的基本程序63 此技术由Southern 1975年首先设计。被检测对象为DNA。 （一）Southern 印迹杂交64Paper TowelsSouthern BlottingtissueSDS蛋白酶K酚/氯仿无水乙醇离心65带有DNA片段的凝胶DNA分子限制片段限制

20、性酶切割琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上转膜杂交、显影凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜Southern 印迹杂交的技术流程661、待测核酸样品的制备 、裂解或破碎细胞 、抽取纯化基因组DNA 、限制酶消化DNA为大小不同的 DNA片段672、待测DNA样品的电泳分离 、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动 快，大小 相同的分子处于同一 条带 、分子量标准：经Hind消化的DNA，杂 交所用分子量标准可用核素 标记 683、凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变

21、性断裂为较短的单链 DNA，中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液。4、Southern印迹 指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。69固相支持物的选择（1）理想的固相支持物应具备的特性 具有较强结合核酸分子的能力 不影响与探针的杂交反应 与核酸分子结合稳定牢固 具有良好的机械性能 非特异吸附少70（2）常用的固相支持物 硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子依靠疏水作用而吸附在膜上，结合不牢固 尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结

22、合能力较低7172737475Southern印迹的常用方法 利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上。（1）毛细管虹吸印迹法76白瓷盘玻璃板滤纸凝胶尼龙膜滤纸吸水纸玻璃板重物吸水纸转膜7778（2）真空转移法 此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真

23、空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。79真空转膜槽滤纸尼龙膜凝胶盖子+-真空转膜8081（3）电转法利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。8283 5、Southern杂交 、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液。 、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA 杂交，双链DNA探针需加热变性为单 链，再杂交。 、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合 的 DNA。846、杂交结果检测 1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针 2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针857、Southern杂交在医学中的应用 1

24、、酶切图谱分析 2、特定基因定性和定量 3、基因突变分析 4、限制性片段长度多态性的分析86（二）Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基 本相同 2、检测目的RNA的存在与否及含量 3、探针可用DNA或RNA片段 4、待测样品为总RNA或mRNA 这是经典的RNA分析法，目前主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。87Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性 2、转膜：RNA转膜前不需变

25、性和中和处理，Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA88 28S18S RNA电泳8990-1，4糖基转移酶在损伤坐骨神经中的表达91Northern 杂交的主要用途 主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。92（三）Western印迹杂交 检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法。93主要步骤：蛋白质样品的制备PAGE电泳蛋白质的电转移：PVDF膜靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗体（一抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应显色反应：

26、酶促反应949596（四）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交Dot blotting and slot blotting原理：是将被检标本的RNA或DNA变性后直接点样吸附于硝酸纤维膜上，然后用标记探针与之杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。 优点：用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析，方法简便、快速、灵敏、样品用量少。缺点：不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。979899(五）原位杂交in situ hybridization 又分为菌落杂交或噬菌斑、以及真核细胞原位杂交。 它是利用标记的已知核酸探针，在组织、细胞及染色体上检测特异的DNA

27、或RNA序列的核酸杂交技术。组织细胞原位杂交是检测细胞内的核酸片段，它保持了细胞的形态结构和组织的立体构型，适合于核酸定位和分布研究。100核酸原位杂交的基本步骤101HPVFISH102菌落原位杂交 菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。103104105液相杂交 指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。RNA酶保护分析法核酸酶S1保护分析法106（六）RNA酶保护分析法1、RNA酶保护分析法原理

28、RNaseA和RNaseT1专一水解杂交体系中的单链RNA，不水解探针RNA与待测RNA互补形成的双链RNA，使杂交分子得到保护，称RNA酶保护分析法。107 待测RNA样品 单链RNA探针 液相杂交 RNA-RNA杂交双链 RNA酶（专一降解未杂交的 RNA单链） 酶解 杂交体系纯化 脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳 放射自显影2、杂交过程108（七）核酸酶S1保护分析法 1、原理 核酸酶S1在一定条件下专一水解杂交体系中的单链DNA和单链RNA，不水解DNA探针与待测RNA杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，称核酸酶S1保护分析法。109 待测RNA样品 单链DNA探针（M13体系合成） 液相杂交 DNA-RNA杂交双链 核酸酶S1（专一降解未杂交的DNA和 RNA单链） 酶解 杂交体系纯化 脲-聚丙烯酰胺凝胶电