盐酸多奈哌齐对戊四氮点燃慢性癫痫大鼠认知功能的影响

1、盐酸多奈哌齐对戊四氮点燃慢性癫痫大鼠认知功能的影响张笋1，2 王维平1* 王佩1王海祥1 周毅2 邢红艳2 闫佳兰2*通作者：王维平，女，教授，博导，河北医科大学第二医院神经内科 050000，Email: 1河北医科大学第二医院神经内科，河北 石家庄 0500002中国人民解放军国际和平医院神经内科，河北 石家庄050082联系方式：张笋 中国人民解放军国际和平医院神经内科 050082电话：军线0-221-78338，地方线手mail: sun_zhang999盐酸多奈哌齐对戊四氮点燃慢性癫痫大鼠认知功能的影响张 笋1，2 王维平1*

2、 王 佩1王海祥1 周 毅2 邢红艳2 闫佳兰2 （1河北医科大学第二医院神经内科，石家庄 050000；2中国人民解放军国际和平医院神经内科，河北 石家庄050082）张笋 王维平 王佩 王海祥 周毅 邢红艳 闫佳兰【摘要 】目的：探讨盐酸多奈哌齐(Donepezildonepezil，Done)对戊四氮（pentylenetetrazole，PTZ）点燃慢性癫痫大鼠的认知功能损害的干预作用。方法：60只SD大鼠随机(?指明具体随机方法)分为2组，分别为盐水对照组(n=18)和癫痫模型组(n=42)，模型组以PTZ腹腔注射（35mg/kg-1.24hd-1）21天造成慢性癫痫大鼠模型后d造成

3、慢性癫痫大鼠模型后，再随机分为PTZ组和Done组，在继续给予PTZ注射的同时，Done组给予Done（1mg/Kg kg ）灌胃21天d是否指Done组注射了42天PTZ+21天Done，停药后采用Morris水迷宫、跳台和事件相关电位P300的方法观察PTZ点燃癫痫模型学习记忆功能的改变、脑电生理的变化以及Done的影响作用。结果：PTZ组水迷宫中逃避潜伏期延长(P0.001)，平台象限游泳时间减少(P0.01)，穿越平台次数减少(P0.05)；跳台试验中反应时间延长(P0.05)，步下潜伏期缩短(P0.05)，错误次数增加(P0.05)；P300峰潜伏期延长(P0.05)。在水迷宫和跳台

4、试验的测试初期，Done组与对照组相比有明显差异（P?），但在测试后期无明显区别，P300峰潜伏期无差异。结论：PTZ点燃的慢性癫痫大鼠有空间学习记忆能力等认知功能的障碍，盐酸多奈哌齐可改善癫痫大鼠的认知功能，对空间记忆能力。的提高尤为明显。【关键词：】癫痫，；认知功能，；盐酸多奈哌齐【中图法分类号：】R742.1 【文献标识码：】AEffects of Donepezil on the cognitive function of kindled rats by pentylenetetrazole Zhang Sun, Wang Wei-Ping, Wang Pei, Wang Hai-Xi

5、ang, Zhou Yi, Xing Hong-Yan, Yan Jia-Lan, Department of Neurology, The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang, 050000, China【Abstract】Objective To explore the effect of Donepezil on the spatial learning and memory capacity of chronic epileptics model. MethodsSixty male Sprague-Daw

6、ley rats were divided randomly into 2 groups : control group ( n=18) ,in which rats received intraperitoneal injections of the 0. 9 % saline; Model group ( n=42) , in which rat s were injected intraperitoneally with PTZ (35mg/kg.24h in 0. 9 % saline) for 21 days, after completely kindled, divided ra

7、ndomly into PTZ and Done group, Donepezil was orally administrated for 21days in the Done group, meanwhile, PTZ was applied sequentially in 2 groups. After the last application of Donepezil, cognitive function was tested by Morris water maze, step-down test, event-related potential P300. Results The

8、 escape latency, total swimming time in platform quadrant and crossing times in the Morris water maze test were different significantly when compared PTZ group with control group, we obtained similarly results in the step-down and P300 peak latency (P0.05). There were significantly differences in th

9、e early term of water maze and step-down test when Done group compared with control group (P0.05), however, no differences were found in the late term of water maze and step-down and P300 test. Conclusion PTZ kindled rats are cognition impairment and Donepezile can significantly improve the cognitiv

10、e function of chronic epileptics rat, especially the spatial memory capacity. 【Key words】 ： epilepsy, cognitive function, Donepezil癫痫是一种以脑神经元反复过度异常放电引起神经功能失常的慢性脑部疾病。临床发现很多癫痫患者除癫痫发作症状外，常伴有学习记忆功能受损，极大的影响了患者的生存质量【1】。盐酸多奈哌齐(donepezil，Done)（Donepezil）是一种胆碱酯酶抑制剂，临床用于治疗轻中度阿尔茨海默病(AD)和认知功能障碍，可明显改善AD患者的认知功能。但

11、Done是否能影响癫痫引起的认知功能改变尚无明确结论。本试验拟采用本实验拟采用Morris水迷宫、跳台和事件相关电位P300的方法观察PTZ点燃癫痫模型学习记忆功能的改变、脑电生理的变化以及Done的影响作用。1、 材料与方法：1.1实验动物与分组 78周龄健康雄性SD大鼠(河北医科大学实验动物中心提供) 60只，实验起始体重实验起始体质量(20020)g，12 h光亮黑暗条件、2225 环境温度，分隔喂养；随机分为: 点燃组(n=26)和对照组(n=10)。造模过程中出现死亡或不符合模型要求者，予以剔除并随机补充。保证每组动物10 只。1.2 模型建立 模型建立方法与以前报道相似【2】。点燃

12、组腹腔注射PTZ溶液(美国Sigma公司，批号074G1845，浓度为10mgml，用生理盐水溶解）35mgkg-1d-135mg/kg.24h，直到连续3次出现Racine 级痫性发作。对照组同时腹腔注射同等容量的生理盐水。经21次注射造模成功后，点燃组又随机分为: PTZ组和Done组。Done组在每日注射PTZ前以Donepezil（法国辉瑞公司，批号， 浓度为0.2mg/ml，用生理盐水溶解）灌胃，剂量为1mg/Kgkg。PTZ组在PTZ腹腔注射前，以同等容量生理盐水灌胃。最后一次发作最后1次发作24h后行各组动物随机分为3组，分别进行水迷宫，跳台行为学测定及事件相关电位P300监测。

13、1.3 Morris水迷宫实验 (Morris water maze test) (提供装置的来源)？迷宫为一直径1.2 m、高0.5m圆形水池，划为四个象限盛水后加适量奶粉，使水成不透明乳白色，水温控制于2225 。将一直径11cm，高25cm的圆形透明平台固定于某一象限，平台隐于水平面下1cm。1.3.1 定位航行试验(place navigation test) 试验前一天大鼠在水池内自由游泳试验前1d大鼠在水池内自由游泳2 min，熟悉环境。试验进行4.5 d，每天上、下午各4次，共9个时间段36次实验，每次每只大鼠随机从每个象限的中点面壁式人水1次，记录找到站台的潜伏期及搜寻策略等信

14、息。如120 Ss仍未找到站台，由操作者将大鼠引上站台休息30s并将潜伏期记为120s，以分析动物获取空间信息的能力。1.3.2 空间探索试验(Spatial spatial probe test) 于第5d5天上午完成4次定位航行后，下午第5次试验时将站台撤除，选定和站台区域相对的象限中点为人水点，记录大鼠在120 Ss内为搜寻站台而穿过站台区域的次数、时间比例，以判断动物记忆储存及提取再现能力。1.4 跳台试验 跳台箱分隔为两室，每室中央置一高5cm、直径约6cm的安全平台，作为动物逃避电刺激的安全区，箱底铜栅接36V交流电。实验第一天时实验第1天时，大鼠放入箱内熟悉环境5min，然后将动

15、物放置反应箱内的铜栅上，立即通电, 记录大鼠跳上安全台的反应时间(reaction time，RT)，并记录其第一次跳下平台的步下潜伏期（step-downlatency，SDL）以及5min内从台上跳下受到的电击次数(错误次数，errors)，以此作为学习成绩（记忆获得）。24 h后进行重测验，将大鼠放在平台上，记录其第一次跳下平台的潜伏期及记录其第1次跳下平台的潜伏期及5min 内受到电击的错误次数，此为记忆巩固。停止训练3天后d后，在相同的时间重新进行一次试验，为记忆消退实验（记忆再现）。1.5 颅外P300记录方法 PTZ和Done组均于末次给药后第一天进行组均于末次给药后第1天进行P

16、300测定，方法参照文献【4】，具体如下：置动物于自制限制笼中,动物头前方装有听觉刺激扬声器，参考电极置耳部,尾部接地,记录电极和参考电极阻抗均小于2k。采用肌电诱发电位仪(加拿大,Neuro公司,Max1004型)的听觉程序进行记录,非靶刺激频率为2,占刺激总数的80%,靶刺激频率为8,占刺激总数20%,靶刺激随机分布于非靶刺激中，靶和非靶刺激持续时间均为50ms, 刺激间隔2s, 刺激强度120dB, 滤波带通为0.1-100Hz。记录顶叶300,叠加多次待动物安静状态下出现稳定可靠的300波形后,记录分析第二轮记录分析第2轮P300。以P300前一波的波峰为起点,第二波第2波P300的波

17、峰为止点,测量峰-峰幅度值（Amplitude）,同时测定峰潜伏期时(Peak latency)。1.6 统计学处理 数据以均数 标准差( S)表示，采用SPSS12.0统计软件进行数据处理，依资料性质分别进行计量资料成组t检验, 秩和检验或方差分析。2、结果2.1 慢性癫痫模型建立情况 对照组18 只大鼠腹腔注射生理盐水21d 后未见发病；点燃组42只大鼠，腹腔注射PTZ21次后有6只因持续性强直发作而死亡，另外36只产生至少3次以上的全身强直阵挛发作(IVV级)，达到完全点燃。36只点燃组大鼠随机分为PTZ组(n=18)和Done组(n=18),实验过程中，两组动物之间的癫痫发作次数和发作

18、级别无明显差异。2.2 Morris 水迷宫行为的测定2.2.1 寻找平台潜伏期的差异： 从图1可见, 随着大鼠学习次数增加, 各组寻找平台潜伏期的时间逐渐缩短。训练初期PTZ组与对照组相比有明显差异（P0.001），随着学习训练次数的增加两组间差异下降， 但仍有显著差异（P0.05）；训练初期Done组与对照组相比有明显差异（P0.05），但在第3时间段时两组寻找平台的潜伏期已经无明显差异，而Done组与PTZ组各时间段相比均有明显差异，说明Donepezil可明显改善慢性癫痫发作大鼠的空间学习能力结论性语句不要放在结果中，见图1。图1 9个时间段中3组在寻找平台潜伏期的比较（请将英文图题删

19、除）注：*指与control组相比，#指与Done组相比（应与PTZ+生理盐水组比？）2.2.2 空间搜索差异：从表1 可见, PTZ组对平台空间位置的记忆能力较对照组差, 差异有显著性( P 0.001)，而Done组空间记忆能力与对照组相比无明显差异，与PTZ组相比差异明显( P 0.05)。表1 各组在平台象限停留时间和穿越次数的比较Table1 Comparison of time spend in the platform region and crossing times in each groupGroupnTime spend (s) Crossing timesControl

20、1867.418.3210(9, 10.5)PTZ1842.9710.93*8(5.75, 9)*Done1871.368.66#10.5(10, 12) #注：*指与control组相比，#指与PTZ组相比，#,*P 0.05，* P 0.01。（书写格式：a:P0.05,与对照组比较）2.3 跳台试验行为的测定2.3.1第一次测试时第1次测试时，受电击后PTZ组大鼠的RT与对照组相比明显延长（P0.05），Done组大鼠的反应时间较PTZ组缩短，但无明显统计学差异；PTZ组大鼠的SDL与对照组相比明显缩短（P0.05），说明Done可提高慢性癫痫发作大鼠的学习能力。Done组与PTZ组相比

21、无明显差异。结论性语句不放在结果中，放讨论中叙述2.3.2 （缺小标题）24h后第二次测试发现后第2次测试发现，PTZ组的SDL与对照组相比明显缩短（P0.05）；Done组与对照组相比无明显差异，且Done组与PTZ组相比有明显差异（P0.05）。错误次数的统计学分析得出相同结果，说明Donepzile可提高慢性癫痫发作大鼠的记忆能力。96h后第三次测试结果相同后第3次测试结果相同。表2 跳台试验中各组反应时间，步下潜伏期和错误次数的比较（表2请翻译成中文）Table2 Comparison of reaction time, step-down latency and error in t

22、he step-down test in each group GroupTraining testRetention test (24h)Retention test (96h)Reaction time(s)Step-down Latency(s)Step-down Latency(s)ErrorsStep-down Latency(s)ErrorsControl20.2313.1436.1710.41129.3329.641(0, 2)261.1236.730(0, 1)PTZ46.1723.65*10.335.94*64.3338.73*3 (3, 5)180.2268.45*2 (1

23、, 3)Done30.5015.7826.9515.83#106.0228.53#1(1, 2)278.4340.01#0(0, 1)注：*指与control组相比，#指与PTZ组相比，#,*P 0.05。（格式：a:P0.05,与对照组比较）2.4 P300潜伏期及峰值的测定在顶叶可记录到稳定的P300波形，具有可重复性。表3为各组P300潜伏期（P300 PL）和波幅平均数值，可见PTZ组与对照组相比有明显差异（P0.05），而Done组与对照组无差异，与PTZ组相比有明显差异（P0.05）。表3 各组P300峰潜伏期和峰值的比较（翻译成中文）Table3 Comparison of P3

24、00 peak latency and amplitude in each groupGroupP300 PL (s)Amplitude(V)Control238.7527.1913.523.72PTZ318.7135.48*12.974.16Done245.2634.66#12.194.33注：*指与control组相比，#指与PTZ组相比，#,*P 0.05。(注释书写格式见表1)3、讨论由于PTZ本身无神经毒性作用，PTZ致痫模型不伴有神经元的坏死，且较好的模拟了人类癫痫反复发作的特点，病理学改变为海马区神经元逐渐变性、坏死、缺少矛盾？如何解释？，所以PTZ点燃的大鼠慢性癫痫模型常被用来

25、研究反复慢性癫痫发作后认知功能改变。本试验通过Morris水迷宫、跳台试验和事件相关电位P300从行为学和电生理研究充分证明了PTZ点燃的慢性癫痫发作大鼠具有空间学习记忆和认知功能的障碍，而盐酸多奈哌齐可明显提高慢性癫痫大鼠的认知水平。事件相关电位(event related potentials, ERP)是用于检测大脑认知功能的一项电生理技术，是大脑接受特定刺激后所产生的电位变化。ERP HYPERLINK 应用最广泛的是P3波电位，因其潜伏期常在300 ms左右故而简称P300。300波潜伏期主要反映大脑对外来信息的认知加工过程, 300波幅不仅反映高层次的认知功能,也反映一定程度的情感

26、投入。P300潜伏期越长，波幅越低,提示大脑对外来信息的感受能力越差。既往的研究已经发现癫痫患者P300的潜伏期延长，波幅降低，而且这种改变与癫痫发作的次数呈正相关【4】。我们的实验证明慢性癫痫发作后大鼠的P300潜伏期明显延长，而波幅并无明显变化，说明慢性癫痫发作虽明显损害大鼠的认知功能，但对于情感反应的影响不明显。300测定与Morris水迷宫、跳台试验的结果一致，说明P300作为一个客观的电生 HYPERLINK /lixue/ 理学指标，对认知功能损害的早期评定具有重要的价值。Done能明显改善AD病人患者的记忆功能，既往的研究已经证明癫痫大鼠模型海马Ach阳性纤维明显减少，而补充胆碱

27、可以减轻癫痫引起的认知功能障碍，而且Done活化胆碱能系统，可引起刺激大鼠海马齿状回神经干细胞分化为神经元，并增加cAMP效应结合元件蛋白（CREB）的表达，从而提高记忆功能【5】。Jia等【6】在PTZ点燃造成幼年小鼠慢性癫痫模型后，给予Done 1mg/Kgkg灌胃可明显提高处于发育期的慢性癫痫小鼠的学习和记忆能力，而有23名癫痫病人患者参与的一项随机双盲安慰剂对照研究发现口服盐酸多奈哌齐3个月后不会加重原有的癫痫症状【7】，但学习及认知和其他相关的精神心理障碍并无明显改善，研究者认为病例偏少及未能详细分组可能是造成阴性结果的原因。本试验在Morris水迷宫和跳台试验的结果均表明Done对

28、于空间学习的改善并不明显，但能显著提高慢性癫痫大鼠的空间记忆能力，不仅对短期记忆对于长程记忆也有明显的改善作用。电生理的观察发现Done还明显缩短慢性癫痫大鼠P300潜伏期，进一步说明了Done能改善慢性癫痫大鼠的认知功能。本结果说明慢性癫痫大鼠具有空间学习记忆和认知功能的障碍，并可通过口服Done明显改善，但Done的作用机制及临床应用效果尚须进一步观察与探讨。参考文献(请参照文献1的格式修改下列文献)1、陈子怡，周列民，孙星海，等。.癫痫患者的认知功能损害及其独立危险因素分析J.，中国神经精神疾病杂志，2006, 32（2）146-149。.2、王维平，娄燕，李攀等，癫痫后学习记忆障碍大鼠

29、海马中脑源性神经营养因子表达的变化，第二军医大学学报，2007，28（5）488-491.3、赵莘瑜，大鼠事件相关电位P300和行为学测试，郑州大学学报（医学版），2005，40（1）：74-76。4、 HYPERLINK /sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Chen%20RC%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlusDrugs1 Chen RC, HYPERLINK /sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Tsai%20SY%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstrac