生物发光检测法分解课件

1、ATP生物发光技术 食品加工与安全研1301 胡程萤火虫栉水母发光海虫腰鞭毛虫发光蘑菇初识生物发光生物发光是指生物自身发光细胞构成发光器而发光。生物发光属于化学发光的范畴，化学能转化为光能的效率几乎为100%。发光机制：细胞合成的化合物质，在特定酶的作用下，使化学能转化为光能。近年来，多种生物发光技术已经广泛应用到科学的各个领域，其中ATP生物发光技术是应用比较成熟的一种技术。ATP生物发光技术历史发展ATP 生物发光法检测ATP 含量最初在1949 年被阐述。ATP生物发光技术产生于20世纪70年代1963 年McElroy最先引入荧光素酶-ATP 检测法，发现反应的结果是把化学能转化为光能

2、。ATP生物发光技术历史发展1983 年，Moyer等最早提出细胞内源性ATP 含量可以反映细胞的活性和活细胞的数量。同年Gronroos等也证实该技术是一种可靠、灵敏度高的确定细胞活性度的检测方法。20 世纪80 年代，英国人首先研制出ATP 检测仪，并逐步发展到欧洲、美国和日本。20世纪末，ATP 检测仪及技术被引进我国。ATP生物发光法原理D-荧光素+ATP+O2 Mg2+荧光素酶Oxy-荧光素+AMP+PPi+H2O+荧光第一步：荧光 ATP 其他底物过量，荧光强度与ATP含量成正比。第二步：ATP 微生物数量ATP仅存在于活的生物体中，且每个细胞的ATP含量大致相同，因此可通过ATP

3、的含量确定活的微生物的含量。总思路：荧光 ATP 微生物数量ATP生物发光法检测步骤取样样品ATP的提取添加荧光素-荧光素酶测定生物发光值计算出ATP的浓度和活菌数量关键点ATP的提取 游离的ATP的去除 提取剂的选择 提取条件的优化反应条件的优化 D-荧光素浓度、萤火虫荧光素酶浓度、反应pH、温度便携式荧光光度仪荧光分光光度仪ATP生物发光技术举例实验目的：探索提取以及反应的最佳条件分别用ATP生物发光法和菌落计数法测定五种样品（青岛啤酒、三鹿君乐宝酸奶、三鹿君乐宝高该酸奶、双汇王中王火腿和康师傅妙芙欧式蛋糕）中的细菌含量，并比较这两种方法的相关性。实验主要仪器与试剂仪器 搅拌机、离心机、微

4、孔板、微孔振荡器、微孔板发光分析仪试剂 ATP、萤光素、萤光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、小牛血清白蛋白（BSA）、三氯乙酸、缓冲溶液、双氧水反应影响因素考察以及标曲图绘制影响因素 pH、温度、BSA浓度标准曲线的绘制 移取100 L ATP 标准溶液加入微孔板, 再加入100 L 虫萤光素-萤光素酶底物溶液, 微孔板振荡器上混匀1 min后立即室温检测。以ATP 浓度和发光强度分别取对数进行线性拟和。反应影响因素考察以及标曲图绘制 pH对发光反应的影响温度对发光反应的影响 BSA浓度对发光反应的影响ATP生物发光反应标准曲线样品ATP的提取用生理盐水稀释酸奶和经过搅拌机绞碎的火腿及蛋糕样品。三磷

5、酸腺苷双磷酸酶用于清除样品中所含游离ATP。将前处理好的样品与pH 7.4 的缓冲溶液等体积混合, 沸水浴中加热3 min 提取ATP, 12000 r/min 离心1 min，取上层清液待测。样品ATP提取方法的优化三种ATP提取方法比较a- 双蒸水体系煮沸; b- 磷酸盐缓冲体系煮沸; c- 三氯乙酸裂解实验了3 种提取食品中细菌ATP 的方法。分别为双蒸水、磷酸盐缓冲溶液加热提取和三氯乙酸( 0. 03% TCA) 室温化学裂解方法。3 种方法提取结果见右图测定样品生物发光值移取100 L 样品提取液加入微孔板, 再加入100 L 虫萤光素-萤光素酶底物溶液, 微孔板振荡器上混匀1 mi

6、n后立即室温检测得出发光值。计算出ATP的浓度和活菌数量对照由标准ATP试剂测量所得发光值和ATP的浓度标准曲线，根据发光值得到ATP的浓度，最后转化为微生物的浓度。与传统方法的比较生物发光法检测结果与传统方法培养结果相关比较同时参照GBPT 4789. 2- 2003 ，采用传统方法培养样品中细菌, 进行菌落计数，其结果与ATP生物发光法方法检出ATP浓度相比较。ATP生物发光技术优点检测灵敏 操作简便 结果快速准确率较高 测定范围广 ATP生物发光技术缺点受游离ATP和体细胞的影响 无法鉴定细菌种属 试剂昂贵 酶促反应影响条件多 某些时候灵敏度不够 ATP生物发光法在食品领域的应用食品快速筛选和检测（微生物的快速检测） 肉品新鲜度，乳制品中的乳酸菌，啤酒中菌落总数，脱水蔬菜的细菌学测定，粉状食品和调味食品的细菌学测定。食品生产设备与环境 色素、致癌物 农药残留 其他领域的应用医学领域 药物敏感性试验，新药筛选和药物评价。 细胞学领域 细胞免疫活性检测。 环境工程领域 污染物浓度变化。 未来优化方向可以尝试将ATP 生物发光法与DNA 分子识别结合起来，可以鉴定菌种。建立最优的游离ATP 去除体系。找到最佳的微生物ATP