研究内容与方法标书撰写2016nov

1、标书研究内容与研究方法撰写体会刘成海上海中医药大学肝病研究所Nov 17，2016题目等基本信息、项目组主要成员、经费预算报告正文 立项依据与研究内容立项依据研究内容、研究目标、以及解决关键问题拟采用的研究方案及可行性分析特色与创新年度计划与预期结果研究条件与工作基础国家自然科学基金等2# 为何要做？1# 做什么？4 # 能不能做？3# 怎样做？国家自然科学基金同行评议意见表3# 怎样做？注意重复“主动”检索内容与方法 容易出现 可疑“重复”与既往课题组有衔接内容、相似方法重复与他人的内容方法重复判断少数：真的重复，抄袭、一稿多投部分：延续性内容、相似方法 虽然文字重复，但实质内容异部分：检测

2、重复比例低，但实质性重复2. 项目的研究内容、研究目标、 以及解决关键问题（此部分为重点阐述内容）要求: 研究内容 合适、研究目标 突出、以及解决关键问题 准确不同写法1# 问题导向：一个问题下面，一块目的与内容。表述很细，而第3部分- “研究方案”则集中于技术方法，表述简单。2# 思路导向：总体研究思路 内容目标 归纳“关键问题” 。常有重叠交叉。“法无常法”，思路 与 问题 要理清楚哪里去找思路 Good Idea ？实际是“选题”人的正确思想是从那里来的？是天上掉下来的吗？ 不是。是头脑里固有的吗？也不是。人的正确思想只能从社会实践中来，只能从社会的生产斗争、阶级斗争和科学实验这三项实践

3、中来。 -毛泽东学而不思则罔；思而不学则殆。-孔子好的选题是成功一半Idea观点思路卖点（Selling points） ，如何做成一个出色的 Grant，卖给 Reviewers ？Why should you give me the money?阐明发病 / 药理机制的理论价值潜在临床意义和应用价值-基础（科研）应用（临床）论文病人（产品）理论技术应用于具体病人问题/样本/信息 分析研究中医 内涵现代 技术通用 规范科研与临床的协调发展以中医理论为指导以临床疗效为基础以实践转化为导向注意从实践中发现“问题”、获得“思路”应用基础举例消胀贴膏制剂对肝硬化腹水的作用评价肝硬化腹水患者试验组(4

4、9)对照组(50)基础治疗（利尿药限制使用）+ 安慰剂，敷脐，1天1次基础治疗（利尿药限制使用）+ 消胀贴膏，敷脐，1天1次特点效应如何发挥？ 临床现象：消胀巴布剂辅助治疗肝腹水时多具有排气增多、腹胀减轻、纳食增加等胃肠动力反应。思考：如何“气行则水行”，外用药物行气以利水？-在于调节胃肠动力，降低腹内压，提高肾灌注压，增加肾血流量。透皮效应物质及其代谢特征？“(商陆)治肿满、小便不利者，以赤根捣烂，入麝香三分，贴于脐心，以帛束之，得小便利即肿消”2015基于胃肠动力改变探讨消胀贴治疗肝硬化腹水的作用机制 /2016 中药2.1 研究内容告诉读者专家 您要做什么？建议先简述一下总体工作思路，尤

5、其是精心推敲出一个“思路示意图”基于 XX 进展/问题/前期工作，提出 XX 假说，通过 如图所示工作，达到XX目的研究内容 则按图说话，分段表述例：2005丹酚酸B影响TGF-受体与Smads蛋白功能的抗肝纤维化作用机制HSC/动物肝脏TGF-1刺激TGF-受体(I/II)蛋白与基因表达结合功能(Bmax, Kd, IC50, KI, 亲和标记)TR-I胞内激酶活性胞内信号分子(R-,Co-,I-)Smads表达R-Smads磷酸化核转位DNA结合活性生物效应PAI-1蛋白与基因表达胶原蛋白与基因表达HSC活化（-SMA表达）肝纤维化（胶原沉积）丹酚酸BTR-IINPC-34016干 预总体

6、工作思路示意图【研究内容】 在既往丹酚酸B抗肝纤维化临床疗效与拮抗TGF-1促肝星状细胞胶原基因表达的工作基础上，紧密围绕TGF-1促肝星状细胞活化与肝纤维化的关键病理机制，针对TGF1TRSmads信号转导通路能作用，进一步探讨丹酚酸B影响TGF-受体与胞内Smads信号分子功能的抗肝纤维化关键作用机制。 1 肝纤维化过程中模型大鼠肝组织TR及Smads蛋白的表达与活化特点，丹酚酸B预防与治疗用药对纤维化肝脏TR及Smads蛋白表达与活化的干预作用。 复制大鼠肝纤维化模型，以丹酚酸B预防与治疗给药，以可溶性TR-II受体为对照，动态观察纤维化肝组织TGF-1及其I、II型受体表达，Smads

7、蛋白表达、磷酸化及与DNA结合活性的变化，探讨肝纤维化形成过程中肝组织Smads蛋白表达与活性的变化特点，丹酚酸B影响纤维化肝脏TGF-受体与Smads蛋白表达活性的抗肝纤维化作用机制。 2 丹酚酸B对HSC内源性与TGF-1刺激后TGF-受体与Smads蛋白表达与功能的影响。 分离并原代培养大鼠HSC，以TGF-1刺激，丹酚酸B干预，并以可溶性受体或受体胞内激酶抑制物为对照，观察普通培养HSC与TGF-1刺激HSC中TGF-受体蛋白与基因表达、TR-I胞内激酶磷酸化及受体结合功能，Smads蛋白表达、磷酸化、核转位与DNA结合的活性，及细胞活化等生物学效应变化，探讨丹酚酸B干预TGF-1细胞

8、信号转导的主要作用环节与特点。研究内容 要 合适针对研究目的（假说）决定研究内容；小心求证， 小题大做，深做， 不要大题小做，浅做，处理“深入”与“全面”的矛盾避免研究内容不足以得到预定目的（小于，少于）避免研究内容超越预定目的（大于，多于）2.2 研究目标 （要突出）告诉 您要 获得的结果/目的- Goal与研究内容相对应，每个阶段性、具体的目标发现、明确、阐明、诠释、建立-【研究目标】 探讨大鼠肝纤维化形成过程中肝脏Smads蛋白表达与活性变化特点，明确丹酚酸B体内预防与治疗用药对纤维化肝组织TGF-受体与Smads蛋白表达与活性的干预作用。 着重探讨丹酚酸B对TGF-1刺激肝星状细胞中T

9、GF-受体表达与结合功能、胞内Smads蛋白表达、磷酸化、核转位及与DNA结合活性水平等的影响，明确丹酚酸B抗肝纤维化的关键分子药理机制，促进药物的临床应用，提高对肝纤维化病理机制的认识，提高抗肝纤维化药理研究水平。2.3 拟解决的关键科学问题 （要准确）选题 时关键思考（思路）所在；完成本研究在理论上和技术上的“瓶颈”所在；获取针对科学假说的关键证据，是实验设计之核心没有问题 是 最大的问题！常见误区：将技术手段或实施过程视为科学问题，如收集样本与采集信息、PCR、模型建立、某种活性成分检测等。 【拟解决的关键问题】 TGF-受体放射性分析方法的建立，及丹酚酸B对肝星状细胞TGF-受体结合功

10、能的影响。 丹酚酸B对肝星状细胞与纤维化肝组织R-Smads尤其是Smad3活性功能的影响，及其与Smad7表达变化的关系。 丹酚酸B干预TGF-1TRSmads信号转导通路以抗肝纤维化的主要作用环节。关键科学问题虫草能否通过调节细胞免疫/NK而发挥抗肝纤维化作用？分子细胞药理机制如何？主要效应物质基础？虫草（菌丝）在纤维化疾病、肝损伤中广泛应用，疗效确切；虫草具有明显的细胞免疫调节作用；细胞免疫与肝纤维化的发生发展与消退痊愈有明显关系。 举例 2011虫草菌丝调节NK功能的抗肝纤维化免疫机制与关键物质立项依据总体思路关键问题问题？思路？选题？我追寻我所得不到的，我得到了我所不追寻的。-泰戈尔

11、有心栽花花不开，无心插柳柳成荫-增广贤文无意中发现：丹参优于虫草（补益）；那么：活血化瘀中药 也有很好免疫调节？举例 2016 基于PD-L1/PD-1信号通路研究丹参调节自然杀伤细胞功能抗肝纤维化的作用机制3. 拟采取的研究方案及可行性分析(包括研究方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明)研究方案告诉评委您 打算怎么做？紧扣 研究内容 设计方案，根据方案选择方法。分类分部进行方案合理可行， 方法有所创新Control! Control! Control!多方法 / 多方面 / 多层次; 少平面 顺序可先粗后精，先易后难，药效机制。每一个部分（方案1/2/3-），建议有主题，“技术路线”先行

12、，而后看图说话技术性建议材料 （清楚）药物：规范名称、组成与剂量、来源等中药质控：基元品种、鉴定、制备、标准制剂等关键抗体、探针：来源、特性等模型制备与分组 （顺序与构成清晰）适当图表，加强表述主要观察指标与方法指标精要，不要平面堆砌一般方法: 关键要素，不要“试剂盒方法”/“教科书式”关键方法: 详细描述，引证文献统计学处理分析 （规范 正确）数据处理方法及标准、的统计工具及软件名称举例 中药（方）来源及其质量控制药物中药复方的组成: 药物、(植物)来源、药用部位、剂量等中药复方的质量控制：主要制备工艺、主要成分指纹图谱等单味药物质量控制：药物来源、主要成分及其含量等Example 1. T

13、he formula of FZHY (扶正化瘀方，one dose)Chinese name Plant sources Medicinal partsAmount in preparation (g)Danshen(丹参)Salvia Miltiorrhizae Bge. (Labiatae)radix8Chongcaoartifical fermentation cordycepsmycelia4TaorenPrunus persica (L.) Batsch(Rosaceae)fruit2JiaogulanGynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino

14、(Cucurbitaceae)whole herb6SonghuafenPinus massoniana Lamb.(Pinaceae)pollen2WuweiziSchisandrae Chinensis (Turcz.) Baill.(Magnoliaceae)fruit2Example 2. 复方中成药的质量控制 Fig.X. The chromatographic prole of FZHY extracts Stationary phase: CNW Athena C18-WP(4.6mm150mm, 3m), ow rate:1 mL/min). Peak No.: 1. dans

15、hensu; 2. protocatechuic aldehyde; 3. rosmarinic acid 4. salvianolic acid B; 5. schizandrol A; 6. schizandrol B; 7. schizandrin A; 8. uridine 9. guanosine; 10. adenosine.To control the FZHY extracts quality, the fingerprint spectrum was established by high performance liquid chromatography (HPLC) me

16、thod. The chromatographic prole of the extracts was shown in Fig. 1. The contents of adenosine and danshensu were respectively 2.5mg/g and 8.04mg/gThe ratios of dry extract 12.85%举例 动物实验与细胞实验 分组图示组别 培养系 正常细胞 TGF-1刺激细胞空白对照组M199M199100 pM TGF-1药物对照组TR-IIM199 + TR-IIM199 100 pM TGF-1+ TR-II药物对照组34016M1

17、99NPC-34016M199100 pM TGF-1NPC-34016丹酚酸B 1mol/L组M1991M丹酚酸BM199100pM TGF-11M丹酚酸B丹酚酸B 10mol/L组M19910M丹酚酸BM199100pM TGF-110M丹酚酸B表1. 丹酚酸B体外药理实验分组示意图关键技术方法 详细描述！主要观察指标与方法参考文献Ala-Kokko L, Pihlajaemi T, Myers J. Gene expression of type I, III and IV collagens in hepatic fibrosis induced by dimethylnitroami

18、ne in the rat. Biochem J, 1987; 244: 75-79.（动物模型制备方法）胡义扬, 刘 平, 刘 成, 等. 丹参提取物对CCl4和DMN诱导的大鼠肝纤维化的影响， 上海中医药杂志，1999; 10: 710.（整体动物实验丹酚酸B用量）George J, Roulot D, Koteliansky VE, et al. In vivo inhibition of rat stellate cell activation by soluble transforming growth factor type II receptor: a potential new

19、 therapy for hepatic fibrosis. Proc Natl Acad Sci USA, 1999; 96(22): 12719-12724 （TR-II体内体外实验的剂量与用法）Dooley S, Delvoux B, Lahme B, et al. Modulation of transforming growth factor response and signaling during transdifferentiation of rat hepatic stellate cells to myofibroblasts. Hepatology, 2000; 31:1

20、094-1106.（Smads的DNA结合活性分析方法及SBE寡核苷酸探针序列）刘成海，刘 平，胡义扬，等. 丹酚酸B盐对转化生长因子1刺激肝星状细胞活化与胞内信号转导的影响. 中华医学杂志，2002，82（18）：12671272.（细胞模型、体外实验丹酚酸B剂量、TGF-1用量）Liu C, Gaca MDA. Swenson S, et al. Smads 2 and 3 are differentially activated by TGF- in quiescent and activated hepatic stellate cells: J Biol Chem; 2003；278

21、 (13): 11721-11728.（TGF-1刺激浓度，NPC 34016用量与用法）Friedman SL, Yamasak G, Wong L. Modulation of transforming growth factor receptors of rat lipocytes during the hepatic wound healing response: enhanced binding and reduced gene expression pany cellular activation in culture and in vivo. J Biol Chem, 1994;

22、269: 10551-10558（TGF-受体的放射性实验相关方法）举例 研究方案的方法学文献引证例 研究方案(免疫相关题 ) 实验一：探讨乙肝早期肝硬化患者有效抗病毒治疗后肝纤维化差异应答的肝脏NK细胞与HSC病理变化特征先 技术路线再逐步描述样本来源与分组：试验结束揭盲后，选用本项目上海地区三家临床分中心XX样本。-主要观察指标与方法肝组织NK细胞的数量及其抑制型与活化型受体表达：选择NK细胞表面抑制型受体NKG2A、活化型受体NKp46、NKp44以及负性调节因子PD-1，采用免疫组化染色（Envision两步法）。石蜡切片常规脱蜡至水，0.6% H2O2甲醇液清除内源性过氧化物酶，0.

23、2%胰蛋白酶消化，0.2%小牛血清白蛋白封闭，分别滴加上述抗体，37温育1h，滴加二抗（HRP标记抗小鼠抗体，购自Antibody Diagnostic 公司），37温育30min，AEC显色，苏木素复染，中性树胶封片。空白对照以PBS代替特异性抗体。阳性染色结果采用病理数字图像分析，半定量（下同）。肝组织HSC的凋亡：免疫荧光共染，TUNEL染色示细胞凋亡，desmin染色示HSC，激光共聚焦显微镜拍片。-统计学分析 分别进行治疗前基线比较、同组治疗前后比较、治疗后组间比较等。SPSS 18.0软件统计系统进行统计处理，GraphPad Prism 5.0软件作图。计量资料以“均数标准差”表

24、示，组间差别采用单因素方差分析，LSD进行两两比较；计数资料采用Ridit分析；NK细胞NKp46、NKp44、PD-1、NKG2A表达与Ishak评分及-SMA、TUNEL、PD-L1与MICA/B等免疫组化染色半定量结果之间的相关性采用Pearson相关性分析。以P0.05有统计学意义。详细简约详细可行性分析理论原理/研究进展前期工作人员组成 (结构) 技术与设备设施【可行性分析】丹酚酸B有良好的抗肝纤维化临床效果，在多种肝纤维化动物模型中也被证实有良好的抗肝纤维化作用。已明确TGF-1TRSmads的信号转导特点，我们前期工作及国内外同行研究结果已基本了解-我们前期工作已发现丹酚酸B可拮

25、抗TGF-1刺激的HSC胶原基因表达等促活化作用，并抑制其胞内Smad2磷酸化。-推测-。项目组成人员结构合理，年富力强。申请人与主要成员长期从事相关领域研究，熟悉该课题的国际前沿理论进展，掌握动物模型与细胞分类培养 - 等实验技术。125I-TGF-1与各种抗体可购买，所需丹酚酸B标准品与相关基因检测探针的质粒已具备。研究场所与条件优良，且与中科院上海药物所 - 等单位有长期良好的协作关系。4. 特色与创新可分 可合提炼创新点谨慎 “首创”【特色】结合肝纤维化细胞信号转导关键分子病理机制的国际最新研究进展，采用相关先进技术方法，研究我国传统中药（丹参）有效成分丹酚酸B抗肝纤维化的主要分子药理机制。受体(TR)功能、下游信号分子活性及其生物效应相结合，培养细胞与整体动物模型