用于增强结肠癌化疗的肠道菌群葡萄糖醛酸酶响应甘草酸胶束

1、用于增强结肠癌化疗的肠道菌群葡萄糖醛酸酶响应甘草酸胶束结直肠癌(colorectalcancer, CRC)是世界上最常见的恶性 肿瘤之一，严重危害人类健康，且呈现年轻化、发病率和死 亡率屡创新高的特点1.由于大多数CRC患者确诊时即为晚 期，伴随远端转移，失去手术切除的机会.因此，化疗是CRC 的主要治疗手段2.然而，在反复给药后，患者会产生耐药 性从而导致化疗失败.其中，肿瘤细胞表面P-糖蛋白(P-gp) 的过度表达是导致化疗抵抗的主要原因之一 3.P-糖蛋白 可以识别和结合大多数疏水性化疗药物，将药物“泵”到肿 瘤细胞外，降低胞浆内有效药物浓度，从而削弱化疗疗效4. 癌症患者一旦出现耐药

2、性问题，即使改用替代性化疗药物或 者增大药物用量，都很难改善治疗效果，而且会产生更加严 重的毒副作用5.因此，迫切需要解决肿瘤化疗耐药的问 题.抑制肿瘤细胞P-gp表达是增强肿瘤化疗的有效策略.一些 P-gp抑制剂，如基因干扰siRNA能直接沉默P-gp基因表达， 具有良好治疗潜力6.然而，siRNA是带负电的生物大分子， 容易在血液循环中被降解，细胞摄取差且转染效率低7.采 用纳米颗粒8,如脂质体9和聚合物纳米粒子10包裹化 疗药物和siRNA,可以实现二者的高效递送，减少P-gp表达， 增强治疗效果Ul.但是，这些纳米载体通常十分复杂，难 草酸的CMC值为0.57mg/niL,说明甘草酸在

3、浓度高于 0. 57mg/mL时能自组装形成胶束，可以将疏水药物阿霉素包 载在其疏水空腔内，具有高效载药能力.Fig.2ThesynthesisandcharacterizationofDOXGLCSmicel les. (a)Thecriticalmicelleconcentration(CMC)ofglycyr rhizin(GL). TEMimagesof(b)GLCSmicellesand(c)DOXGLCS micelles, (d)ThesizedistributionofGLCSandDOXGLCSmic elles. (e)Thesizestabilityand(f)zetap

4、otentialstabili tyofDOXGLCSmicelles.2. 2胶束形貌和粒径特征图2(b)和2(c)分别是空白胶束GLCS和载药胶束D0XGLCS 的透射电镜照片.照片清晰地显示胶束为规则的球形，分散 良好.动态光散射结果表明，胶束载药前后的粒径分别为252 和165nm,且有较窄的粒径分布(PDI分别为0. 223和0. 164). 包载阿霉素后胶束粒径变小，这归功于正电性的阿霉素对整 个胶束静电体系的平衡，从而使得胶束更稳定，粒径更小(图 2(d).稳定性是纳米载药体系临床转化的重要评价指标.将 D0XGLCS胶束在PBS中保存1周，并于第1、2、3、5和7 天分别测定胶

5、束的粒径和电势.结果如图2(e)和2(f)所示, 胶束在1周内具有良好的时间稳定性，这有利于胶束的体内 长循环，增强疗效.2. 3胶束载药和释药性能研究胶束的载药量通过测定计算为17. 1%,说明该体系能有效包 载疏水药物.DOXGLCS胶束响应肠道菌群触发释药行为如图 3(瑚和3化)所示.经，和$6培养后，药物释放缓慢，24h 内的释药量不足10%.动态光散射结果显示胶束的粒径在整 个过程中也基本保持不变.其优异的稳定性是由于带正电荷 的壳聚糖和阿霉素与带负电荷的甘草酸间的强静电相互作 用相比之下，经SCF共培养后，D0X释放明显，在8h内达 到70%, 24h内达到90%.同样，胶束粒径也

6、随之变大，意味 着胶束结构被破坏.以上结果表明，口服D0XGLCS胶束可以 实现药物在富含细菌的肠道和肿瘤组织中特异性释放，避免 了在胃部的提前泄露.Fig.3Thegutmicrobiota-responsivedrugreleasebehaviou rofDOXGLCSmicelles. (a)ThereleaseprofilesofDOXfromD 0XGLCSmicellesinSGF,SIF,andSCFconditions. (b)Thepar ticlesizesofDOXGLCSmicellesunderdifferentcondition s. (c)TheHPl.Canal

7、ysisofGLafterincubationwithgutmicro biota.TheyellowcurvesrepresentthcGLanddecomposedGLu nderSCFconditions,respectively. Thebluecurverepresen tstheproducedGA.随后，通过高效液相色谱(HPLC)分析肠道菌群对甘草酸的代 谢转化行为.如图3(c)所示，胶束经SCF共培养后，甘草酸 的峰强度显著降低(31min).同时，在27min时出现了甘草次 酸的特征峰，表明肠道菌群转化了胶束中的甘草酸，生成了 P-gp抑制剂甘草次酸.2.4载药胶束的肿瘤细

8、胞抑制效果评估胶束经肠道菌群代谢产生的甘草次酸是一种有效的P-gp抑 制剂，能促进细胞内药物积累，增敏结肠癌化疗.因此，我 们评估了载药胶束在细胞水平上克服化疗耐药性的能力.为 了确保DOXGLCS胶束的安全性，首先对胶束进行生物相容 性研究.如图4(a)所示，空白胶束对正常肠上皮细胞NCM460 没有明显毒性随后，通过MTT法探究了胶束对结肠癌细胞 的化疗增敏作用.将游离DOX和DOXGLCS胶束分别与模拟结 肠液SCF共培养后，测定其对CT26细胞或HCT116细胞的杀 伤效果.如图4(b)和4(c)所示，相比游离DOX, DOXGLCS胶 束具有更强的细胞毒性.将甘草次酸和阿霉素共混后，

9、阿霉 素毒性增强，说明DOXGLCS胶束能增强化疗效果是产生的 甘草次酸的结果(图4(d).Fig. 4Theenhancedcheniotherapyeffectofmicellesinvitro .(a)Thecel1viabi1ityofNCM460cel1streatedbyDOXfreeGL CSmicelles. ThecellviabilityofCT26celIs (b)andHCT116c ells(c)treatedbyfreeDOXandDOXGLCSmi ce11eswi thd i ffe rentDOXconcentrations. (d)Thecellviabil

10、ityofCT26cell streatedbyfreeDOXandDOX+GAwithdifferentDOXconcentra tions. (e)TheCLSMimagesofCT26cellstreatedbyfreeD0Xan dI)OXGLCSmice 11 es (I)0Xconcentrationswere2mg/Land4mg/ L,respectively). ThescalebarislOO u m. (f)Themeanfluor escenceintensity (MFI)ofD0XinCT26cellsmeasuredbyflow cytometer, (g)The

11、P-gpexpressionofCT26cellstreatedbyf reeDOXandDOXGLCSmicelles.共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)结果显示相比游离DOX, DOXGLCS胶束处理后的CT26细胞具有更强的荧光强度，意 味着更多的DOX积累(图4(e).流式定量结果进一步表明， 该胶束显著提高了肿瘤细胞对阿霉素的摄取能力(图4(f). 为了证明DOXGLCS胶束通过抑制肿瘤细胞P-gp的表达来提 高药物摄入，通过定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)分析 肿瘤细胞在mRNA水平上P-gp的表达情况.与DOX处理相比， DOXGLCS胶束显著地抑制了 CT26细胞的P-

12、gp表达(图4(g). 以上结果表明，DOXGLCS胶束在肠道菌群作用下，生成甘草 次酸抑制了肿瘤细胞P-gp表达,提高了胞内有效药物浓度， 从而增强了阿霉素化疗效果.接着，我们进一步在耐阿霉素CT26细胞株(CT26D0X)中评估 了载药胶束的化疗增敏效果.如图5(a)、5(c)所示，DOX对 CT26D0X细胞的半致死量浓度(IC50)值是正常CT26细胞的3 倍.CT26D0X的P-gp表达也增加了 3倍，表明成功诱导了阿 霉素耐药结肠癌细胞(图5(d).和游离DOX相比,DOXGLCS 胶束表现出对CT26D0X细胞更强的杀伤效果(图5(e).与CT26细胞的实验结果一致，经I)OXG

13、LCS胶束处理后,CT26D0X 细胞P-gp表达也明显降低(图5(f).Fig.5TheenhancedchemotherapyeffectofmicellesforD0X- resistantCT26cellsascomparedwithfreeD0X. Thecellviab ilityofCT26cells (a)andCT26D0Xcells(b)treatedbyfreeD OXwithdifferentconcentrations, (c)TheIC50valueofCT26 cellsandDOX-resistantCT26D0Xcells. (d)TheP-gpexpress

14、 ionofCT26cellsandD0X-resistantCT26D0Xcells. (e)Thece HviabilityofCT26D0XcellstreatedbyfreeD0XandD0XGLC Smicelles. (f)TheP-gpexpressionofDOX-resistantCT26DO XcellstreatedbyfreeDOXandDOXGLCSmicelles.2. 5载药胶束体内抗肿瘤效果评估根据体外实验结果，我们对胶束体内抗肿瘤效果进行了评估. 通过小动物活体成像系统定量肿瘤组织的发光强度，以反映 肿瘤大小.如图6(a)和6(b)所示，DOXGLCS胶束处理

15、的小鼠 生物发光最弱，表明肿瘤体积最小.单独使用GLCS或DOX治 疗组的小鼠生物发光很强，意味着其不能有效抑制肿瘤生长. 治疗结束后，收集各组肿瘤，同样表明DOXGLCS胶束抗肿 瘤效果最好(图6(c).Fig. 6TheantitumorefficacyofmicellesinorthotopicCT26 -bearingmicemodelsascomparedwithfreeDOX. (a)Invivowh ole-bodybioluminescenceimagesoftumor-bearingmicetre atedbyPBS,DOX,GLCS,andI)OXGLCSmicelles.

16、 Threereprese ntativemicepertreatmentgroupareshown. (b)Meanbiolumi nescenceintensityofmiceafterdifferenttreatments, (c) Representativeimagesofexcisedtumorsattheendofexperi ments.为了更好地证明D0XGLCS胶束的化疗增敏能力，我们进一 步建立了原位耐阿霉素结肠癌小鼠模型.如图7(a)所示，对 照组小鼠由于肿瘤负荷过大，出现死亡现象.DOXGLCS胶束 处理的小鼠生物发光最弱，表明肿瘤体积最小.游离DOX不 能有效抑制肿

17、瘤生长.在治疗15天后，小鼠CT成像同样表 明DOXGLCS胶束处理的小鼠肿瘤最小(图7(b).治疗结束后 处死小鼠，收集各组肿瘤组织，HE切片和Ki67免疫荧光染 色显示经DOXGLCS胶束治疗后，肿瘤组织呈现出最明显的 细胞凋亡(图7(c).随后，检测了各组肿瘤的P-gp表达情况. 反复注射DOX后，肿瘤组织P-gp表达明显升高，这与化疗 诱导耐药的临床问题一致.相反地，DOXGLCS治疗显著下调 了 P-gp表达，增强了药物疗效(图7(d).最后，对小鼠肠道 通透性进行了评估.如图7(e)所示，经壳聚糖修饰的载药胶 束DOXGLCS治疗后，小鼠肠道通透性得到了明显改善，说 明该药物递送系

18、统具有良好的肠道黏膜修复功能.Fig. 7TheantitumorefficacyofmicellesinorthotopicCT26 DOX-bearingmicemodelsascomparedwithfreeDOX. (a)Inviv owhole-bodybioluminescenceimagesoforthotopicCT26D0X -bearingmicetreatedbyPBS,DOX,andDOXGLCSmicelles. Th reerepresentativemicepertreatmentgroupareshown. (b)C Timagesofmiceafterdiff

19、erenttreatments, (c)HEimagesan dKi67imagesofintestinaltissuesoforthotopicCT26D0Xtu mor-bearingmicetreatedbyPBS,DOXandDOXGLCSmicelles ( Scalebar=50 5). (d)TheP-gpexpressionofCT26D0Xtumort issuestreatedbyPBS,DOXandDOXGLCSmicelles. (e)Theint estinalpermeabilityofmiceafterdifferenttreatments. 3结论本文设计了一种

20、肠道菌群葡萄糖醛酸酶响应载药胶束用于 克服结肠癌化疗耐药.通过亲疏水自组装，构建包载疏水药 物D0X的GL胶束.随后，在GL胶束表面修饰壳聚糖构建 DOXGLCS载药体系.口服给药后，DOXGLCS在肠道菌群作用 下裂解，释放DOX.同时，细菌分泌的葡萄糖醛酸转化甘草酸 生成甘草次酸，抑制肿瘤耐药蛋白P-gp表达.在2种原位结 肠癌小鼠模型中，DOXGLCS治疗均显著地增强了化疗效果, 并修复了受损的肠道黏膜.该菌群触发释药型胶束为克服 CRC化疗耐药性提供了新策略.以实现大规模生产12.其次，基因药物siRNA和小分子化 疗药物在理化性质和药代动力学上存在很大差异，影响治疗 效率13.再则，

21、siRNA及纳米载体的生物安全性评估也是个 问题14.因此，开发符合临床转化需求的纳米载体克服化 疗耐药十分关键15,16.肠道菌群紊乱在结肠癌发生发展中扮演着重要角色17.文 献表明，结肠癌患者肠道菌群结构发生显著变化，并伴随大 量分泌酶活性的增强:如胆固醇脱氧酶，脱羟酶和葡 萄糖醛酸酶18等.其中，葡萄糖醛酸酶的浓度在结肠区 域和肿瘤部位的活性比正常组织提高12.1倍19.基于此, 本文设计了一种肠道菌群葡萄糖醛酸酶响应的甘草酸自组 装载药胶束(DOXGLCS),实现原位P-gp抑制剂的生成和化 疗药物的递送，从而克服结肠癌化疗耐药(如图1).甘草酸 (glycyrrhizin,GL)是一

22、种从甘草中提取的药用分子，已在 临床上使用了二十多年，具有良好的生物相容性20. GL由 亲水性的葡萄糖酸和疏水性的甘草次酸 (glycyrrhetinicacid,GA)通过糖昔键连接而成21.通过 亲疏水自组装，GL形成胶束，包载疏水性药物阿霉素 (doxorubicin,D0X).同时，在GL胶束表面静电吸附正电性 壳聚糖(chitosan,CS),构建DOXGLCS载药系统.作为一种 前药自组装载药体系，D0XGLCS具有高载药量、高稳定性和 高肿瘤选择性特点22,23. 口服给药后24,胶束在胃和小 肠中保持稳定，并有效地积累到结肠肿瘤区域.这里，细菌 分泌的葡萄糖醛酸酶25迅速水解

23、甘草酸的糖昔键，导致胶 束结构破坏，释放药物DOX.同时，甘草酸转化为P-gp抑制 剂甘草次酸，有效地降低了肿瘤细胞P-gp表达26.在2种 原位结肠癌小鼠模型中，口服DOXGLCS显著地抑制了肿瘤 生长.此外，壳聚糖作为一种益生元，被肠道有益菌代谢， 调节失调的肠道菌群和过激的炎性状态，修复受损的肠道黏 膜27,28.该胶束结构简单，成药性好，高效逆转了肿瘤耐 药，为增强肿瘤化疗提供了新可能.Fig. 1(a) Preparationofgutmicrobialglucuronidase-resp onsiveDOXGLCSmicellesfordeliveryofDOXandinsitug

24、ene rationofP-gpinhibitortoovercomecoloncancerchemother apyresistance. (b)Themolecularillustrationfortheself -assemblyofDOXGLCSmicellesandproductionofP-gpinhib itor,GA. (c)SchematicrepresentationofDOXGLCSmicelle stoovercomeCRCdrugresistanceandintentinalmucosalrep air.1实验部分LI主要原料甘草酸和甘草次酸购自上海麦克林生化科技有限

25、公司.阿霉 素、花和FITC-葡聚糖购自上海阿拉丁生化科技股份有限公 司.壳聚糖、冰醋酸、丙酮、DMSO和三乙胺购自国药集团化 学试剂有限公司.3-(4,5-二甲基嚷哇-2-yl)-2,5-二苯基四 哩澳化铉(MTT)、RPMI1640培养基、Dulbecco改良培养基 (DMEM)、胰蛋白酶、青霉素-链霉菌、喋吟霉素和胎牛血清 (FBS)均来自 GIBCOInvitrogen 公司.1. 2临界胶束浓度(CMC)测定胶束的CMC值根据花荧光探针法测定29.分别向7个样品 管中加入0. ImL花的丙酮溶液(6X10-6mol/L),静置24h, 待溶液挥发完全后依次向样品管中加入ImL不同浓度

26、的甘草 酸溶液(浓度分别为1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.3和 15. 6mg/L),室温静置12h后，用荧光分光光度计检测荧光 强度(发射波长为393nm).以荧光光谱(300360nm)的第三振 动带13和第一振动带II的比值为纵坐标，以甘草酸浓度的 对数为横坐标作图，曲线切线的交点即CMC值.3D0XGLCS胶束的制备将抗癌药物盐酸阿霉素溶于DMSO,加入三乙胺去除盐酸以获 得疏水性药物DOX.将Img脱盐阿霉素溶解于0. 05mLDMS0中，得到药物溶液.将 制得的药物溶液加入到甘草酸(lmg/mL,7mL)溶液中，在室温 下避光搅拌lh,得到GL载药胶束.

27、将Img壳聚糖加入到lniL2%冰醋酸溶液中，搅拌过夜，使壳 聚糖充分溶解将壳聚糖溶液快速加入到上述GL载药胶束溶 液中，超声lOmin, 11000r/min离心收集最终产品DOXGLCS.1.4胶束载药量和体外释药行为测定将lmgDOXGLCS胶束分散于ImLDMSO中，通过DOX在DMSO 中的标准曲线（激发波长为488nm）计算胶束中的DOX含量， 并计算药物的载药量.载药量阴（材料中包载的药物质量/材料的质量）X100%为研究阿霉素体外释放行为，将lmg/mLDOX回GLCS胶束分别 在模拟胃液（SGF,pH=2. 0）、模拟小肠液（SIF,pH=6. 8）和模拟 结肠液（SCF,p

28、H=7.4,20%小鼠粪便滤液）中孵育24h30,并 于1、2、4、8、12、24h收集上清液.释放出的DOX含量通 过荧光分光光度计进行检测，最终参照DOX的标准曲线计算 出累积释放量.累积释放量二（某时刻已经释放的药物量/材料中总的药物 量）X100%1.5粒径、电势和透射电子显微镜（TEM）胶束的粒径和电势在25C条件下用Nano-ZS-ZEN3600（马尔 文仪器）进行测定，所有数据均独立测定3次，并以3次数 据的平均值作为最终测定结果.胶束的微观形貌通过透射电 子显微镜（JEM-2100,日本）进行观测.1. 6高效液相色谱（HPLC）分析采用高效液相色谱法（HPLC）分析肠道菌群对

29、DOXGLCS胶束 的体外降解行为31.简单地说，从小鼠中取0. 5g盲肠内容 物，悬浮在含有lmg/mLDOXGLCS胶束的40mL厌氧培养基中， 将混合物在37CT培养24h,将所有样品液过滤以去除细菌. 在30mL氯仿中超声提取上清液，并将所有的提取物混合在 一起，在水浴中蒸发至干燥.将残渣溶解于甲醇中， 3000r/min离心5min,用于高效液相色谱分析.采用C-18柱 进行测试.流动相为甲醇/乙酸铉溶液(0. 2mol/L)/冰醋酸 (65/34/1, V/V/V)；流速：ImL/min；检测波长为 250nm；进 样20 M L；样品运行时间为40min.1.7细胞摄取实验CT2

30、6小鼠结肠癌细胞在含10%胎牛血清的RPMT1640培养基 中培养(1%青霉素-链霉素，lOOOOU/mL).转染荧光素酶的 CT261uc细胞在添加5%喋吟霉素的RPMI1640培养基中培 养.HCT116人结肠癌细胞和NCM460人正常肠上皮细胞在含 10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培养基培养.采用荧光共聚焦显微镜(CLSM)和流式细胞术探索结肠癌细 胞对DOXGLCS胶束摄取行为.将CT26细胞接种于六孔板并 在37CT培养24h.同时,D0X和D0XGLCS胶束(阿霉素含量 为2和4 U g/mL)分别与模拟结肠液SCF共培养24h.收集上 清，并与CT26细胞孵育4h.将CT26

31、细胞洗涤3次，重悬于 PBS中用CLSM观察细胞内荧光情况.对于流式细胞分析实验, 细胞被消化收集来定量分析材料的内吞行为.1. 8细胞毒性检测用MTT法测定材料的细胞毒性.为了评估GLCS空白胶束对正 常细胞NCM460的细胞毒性,将NCM460细胞接种于96孔板 并在37CT培养24h.然后，分别加入不同浓度梯度的GLCS 溶液(31.3、62.5、125、250、500 和 1000 u g/mL),继续孵 育24h.接着,加入MTT溶液(5mg/mL,10%).4h后，加入 150ULDMS0,在570nm处测定溶解的甲瓒紫的吸光度.为了评估DOX回GLCS胶束的细胞毒性，将CT26细

32、胞或IICT116 细胞接种于96孔板并在37笆下培养24h.同时，将不同浓度 的游离 DOX 或 D0XGLCS 胶束(DOX 浓度：0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、 1.6和3. 2 u g/mL)分别与SCF共培养24h.收集上清液，加入 到CT26细胞或HCT116细胞中孵育24h,用于后续MTT检测. 为了直接证明肠道菌群代谢产生的甘草次酸的化疗增敏作 用，将Img/mL甘草次酸溶液和不同浓度的DOX溶液(DOX浓 度：0.25、0.5、1和2 U g/mL)共混，加入到CT26细胞中孵 育24h,用于后续MTT检测.1. 9 诱导 DOX 耐药 CT26 细胞(CT26D0

33、X)采用浓度梯度递增法诱导耐阿霉素CT26细胞(CT26D0X).详 细地，将CT261uc细胞与含50ngmL-lD0X的培养基共培养24h. 去除死细胞，存活下来的细胞进一步与含50ng/mLD0X的培 养基共孵育.同样地，收集活细胞再进一步培养.经过3个循 环后,CT261uc细胞能在含50ng/mLD0X的培养基中正常生长. 接着，将DOX浓度提高到1 OOng/mL,并重复上述筛选周期. 最终,CT261 uc细胞在含300ng/mLD0X的培养基中生长良好， 证明成功诱导了 DOX耐药的CT26细胞CT26D0X.1.10体内抗肿瘤效果评估所有活体动物实验均遵从武汉大学动物实验中心动物护理 机构和使用委员会及依据动物管理条例