蛋白质序列分析

1、肽和蛋白质的直接测序法目前，肽和蛋白质的测序有三种策略：根据基因测序的结果，从cDNA演绎肽和蛋白质序列，这种策略简单、快捷，甚至可以得到未分离出的蛋白质或多肽的序列信息。但是，用这一策略得到的一级结构不含蛋白质翻译后修饰及二硫键位置等信息；直接测序策略；质谱测序与生物信息学搜索相结合的策略。第种策略可参考分子生物学的有关专著，第种策略将在本书蛋白质组与蛋白质组分析一章中介绍，本章介绍直接测序策略。1953年，FrederickSanger在对牛胰岛素的研究中首先提出氨基酸直接测序的概念，迄今为止，已通过直接测序阐明了几千种蛋白质的氨基酸序列。在蛋白质序列测定中，因为可以得到的蛋白质样品十分有

2、限，而且蛋白质包含的20种不同的氨基酸表现出不同的化学功能和化学活性，在测序过程中每一次变性或裂解所发生的一系列副反应，将使测定过程变得十分复杂，在蛋白质序列测定中由于没有类似于DNA序列测定中采用的PCR技术可应用，因此，与DNA序列测定相比，蛋白质序列测定在许多方面要复杂得多。其基本的测序过程如下所述。确定不同的多肽链数目首先应该确定蛋白质中不同的多肽链数目，根据蛋白质N-端或C-端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量可确定蛋白质分子中的多肽链数目。如果是单体蛋白质，蛋白质分子只含一条多肽链，则蛋白质的摩尔数应与末端残基的摩尔数相等；如果蛋白质分子是由多条多肽链组成，则末端残基的摩尔数是蛋白

3、质的摩尔数的倍数。肽链的裂解当蛋白质分子是由二条或二条以上多肽链构成时，必须裂解这些多肽链。如果多肽链是通过非共价相互作用缔合的寡聚蛋白质，可采用8molL-1尿素，6molL-1盐酸服或高浓度盐等变性剂处理，使寡聚蛋白质中的亚基裂解；如果多肽链之间是通过共价二硫键交联的，可采用氧化剂或还原剂断裂二硫键。然后再根据裂解后的单个多肽链的大小不同或电荷不同进行分离、纯化。太长的多肽片段不能直接进行序列测定，一般肽片段长度不超过50个左右残基的肽段，当肽段超过这个长度时，由于反应的不完全以及副反应产生的杂质积累将影响测定结果，因此，必须通过特定的反应将它们裂解为更小的肽段。通过两种或几种不同的断裂方

4、法（即断裂点不同）将每条多肽链样品降解成为两套或几套重叠的肽段或肽碎片，每套肽段分别进行分离、纯化，再对纯化后的每一肽段进行氨基酸组成和末端残基的分析。使肽链中某些特殊位置上的肽键发生断裂，可采用化学反应或酶反应裂解产生若干能够进行测序的小片段。一般将蛋白质样品分为两等份，采用不同的试剂裂解产生两套不同的片段，两套片段在测序完成后，根据他们之间的重叠情况即可重新排序。1酶解法蛋白质通过蛋白水解酶的裂解后将产生若干能够代表每个蛋白质特性的肽片段，用于特定的蛋白质裂解的蛋白水解酶包括外肽酶和内肽酶，裂解肽链的N-端或C-端的氨基酸可采用外肽酶，而内肽酶则用于切断肽链中某个特定部位。表10.5为常用

5、的蛋白水解酶。表10.5用于蛋白质部分裂解的蛋白酶内肽酶：胰蛋白酶Rn-尸Arg,LysRnPro胃蛋白酶Rn=Leu,Phe,Trp,Tyr,ValRn-1Pro糜蛋白酶Rn-1=Phe,Trp,TryRnPro内肽酶GluCRn-1=GlU亮氨酸氨肽酶氨肽酶竣肽酶A 竣肽酶B 竣肽酶CR1 中 Pro所有N-端残基RnArg, Lys, ProRn=Arg , Lys所有C-端残基Rn-1*ProRn-产 Pro具有高度专一性的胰蛋白酶是最常用的内肽酶，当下一个残基不是Pro时，胰蛋白酶可催化裂解肽链中竣基端（C端）带有正电荷的残基（Arg和Lys）,如式（10.15）。将胰蛋白酶消化所获

6、得的特征片段图谱与数 据库进行比较，即可进行蛋白质的鉴定，因而被作为一种对已知蛋白质进行鉴定的方法。NHR O, ； I：十HJN-C=hlNH10R。IIIII II-c-NH傩”初楼以外的K是国(10.15)在除去裂解位点后，即除去Lys或Arg支链上的正电荷，这个位点上的肽将不再被胰蛋白酶切断。例如,用甲基马来酸好衍生Lys残基，产生一个不带正电荷的Lys支链，则胰蛋白酶不能将其识别作为一个裂解位点，式（10.16）;而在加上裂解位点后，即在其他氨基酸支链上引入正电荷，会产生一个可被胰蛋白酶识别的 新裂解位点。例如，采用如 2-漠乙胺使Cys发生氨基烷基化反应，在Cys支链中引入了一个正

7、电荷，则胰蛋白酶能将其识别作为新裂解位点，式（10.17）。通过上述两种方式，就能够更充分地发挥胰蛋白酶对蛋白质的裂解特性。NH.t-CH-C -NH,C!HjNH(恚仁-C-KH(10.16)oIISH-CH2-CH-C- + BiCHiCHiNH3(H2CH2NH5OII* SH-CU.-CH-C- - HBi觥氨1酸NH2根乙脑NH（10.17）与胰蛋白酶相比较，内肽酶的专一性略差，所产生的肽片段小，与其它肽片段的重叠程度不够，肽片段在蛋白质序列中重新排列时的位置则可能发生错误。对Arg和Lys含量较高的蛋白质，则可采用限制胰蛋白酶水解的方式，亦即通过改变反应条件，缩短反应时间，使酶与肽

8、链接触的机会减小，从而获得符合测序要求的肽片段。Met残基，可在温和酸性的反应条件下,2化学降解法许多化学反应也可用于专一性地裂解肽键，例如，为裂解所有(10.18)采用漠化鼠（CNBr）在C端又Met残基进行专一性的裂解，形成肽基高丝氨酸内酯，如式0IIIJEI/-HNLE-UNHK.ItI片HN-CHY-fNH-NH-岫高赭内国山眺总的来说，为满足测序的要求，有时需要采用不同的处理方法来进行多肽链的裂解，才能得到足够小的 多肽片段。二硫键的裂解二硫键（Disulfide bond ）在两个Cys残基之间形成，可出现在一条多肽链中不同的氨基酸残基之间，也 可出现在不同多肽链中的氨基酸残基之间

9、。测序之前，必须裂解存在于多肽链中或不同多肽链之间的二硫键 以便于分离和展开亚基，同时，蛋白质原有结构的分解也使测序中采用的蛋白质分解试剂能够更好地发挥作 用。裂解反应最好在变性条件下进行，例如，通过加入盐酸服或诸如SDS等变性剂，使紧密结合的蛋白质结构展开而暴露出所有的二硫键，然后加入氧化剂或还原剂使二硫键裂解。常用的氧化剂是过甲酸，它能使蛋白质中所有的Cys残基均被氧化为磺基丙氨酸（无论是否通过二硫键连接），式（10.19）。由于磺基丙氨酸在酸碱条件下都稳定，因此可通过产生的磺基丙氨酸数量推断Cys残基总口 HYPERLINK l bookmark6 o Current Document

10、IIII/居 _c比 _/耳_0_神，内工也111H(10.19)该方法的明显缺点是过甲酸会导致Met残基氧化为甲硫氨酸亚碉和碉，式 （10.20）,也可使Trp残基的口引噪侧链部分降解。 HYPERLINK l bookmark16 o Current Document 0oOOII X&H IIIICHj-S-CHj-CHj-CH-C- jj 甲C-聋执酸 NHONHII(10.20)二硫键也可以用大大过量的二硫苏糖醇（DTT）或疏基乙醇还原为疏基，如式 （10.21）,式（10.22）所示。但是，产生的疏基（-SH）必须用烷基化试剂（例如碘乙酸）处理，以防止二硫键的重新形成，式（10.2

11、3）。所产生的烷基化衍生物在后续测序步骤中的肽裂解条件下十分稳定。+ HiSCHiCHjOB0uiW.HAH.t.iH-C-CH-CHi-SH HS-CHi-iTT-C- +|NHNH(10.21)tHj HiTTOOII1pf SH lie, C.+版丫!=n n jria lei.m”(10.22)0II-C-CH-CHj-SH + lUHQtTI-NH半胱城般OII-c-CH-CHz-scHpoq nrNH保护后的聿跳就酸(10.23)氨基酸组成分析在裂解二硫键后，需要对每个多肽链中氨基酸的组成进行测定。一般将分离、纯化后的多肽链样品分为两部分，一部分样品经过完全水解，测定其氨基酸组成，

12、并计算出氨基酸各种残基的含量；另一部分样品则进彳NN-端或C端测序。一个未知蛋白质的氨基酸组成，可以通过测量氨基酸残基的相对百分比并与数据库进行比较而确定。其测量可通过两个步骤来完成，首先通过酸水解、碱水解或酶水解等方式裂解蛋白质中所有的肽键，继而分离游离氨基酸并进行定量测定。在二硫键裂解之后，蛋白质不同亚基可通过电泳方法如SDS或色谱方法如SEC或RP-HPLC等进行分离。由于每一个氨基酸残基具有大约110Da的分子质量，根据每个亚基分子质量的大小，即可确定氨基酸残基的数量。以往，一般采用SDS或SEC等方法确定蛋白质的分子质量，生物质谱法因为准确度更高、分析速度更快，现在越来越被普遍采用。

13、在酸催化水解中，要寻找理想的水解条件是比较困难的，因为要裂解所有的肽键，必须对氨基酸残基的降解平衡进行综合考虑。一般情况下，不同氨基酸的降解反应是在各自不同的条件下进行，实际的氨基酸组成是从不同的降解实验中推断得到的。通常，为防止氨基酸中的硫被空气氧化，在真空条件下对多肽用6MHCl进行处理，反应混合物需要在100120c保温24小时，而Leu、Val、Ile等脂肪氨基酸则可能需要较长的反应时间才能完全水解。但是，在这样的反应条件下，部分氨基酸残基会发生降解，Trp将被完全降解。此外，在酸催化水解中，Asn和Gln分别转化为Asp和Glu并消去NH4+。对这些氨基酸，必须测定Asx（Asn+A

14、sp）、Glx（Gln+Glu）和NH4+（Asn+Gln）的总含量并进行比较。碱催化水解一般仅用于特殊情况下，多肽在100c条件下与4MNaOH反应48小时，Arg、Cys、Ser、Thr被分解，其它的氨基酸则被脱胺基和外消旋。正因如此，应用碱水解测定Trp含量就受到了限制。由于具有高度的专一性，内肽酶和外肽酶都可用作催化某些肽键水解的酶，Asn、Gln、Trp等含量的测定常常采用酶法。为保证所有肽键的完全水解，一般都采用这些酶的混合物进行催化水解。但是酶本身也是蛋白质，在反应条件下也可以发生降解而污染反应混合物，所使用的酶浓度不能过高，大约在1%左右。上面几种方法都可应用于某些氨基酸的定量

15、测定。但是，要保证使所有的肽键完全水解，而又不引起氨基酸残基的降解，单独采用任何一种方法都不能满足这个要求。因此，要实现多肽中的所有氨基酸的定量测定，可采用两种或三种水解方法的联合应用。水解完成后所得到的游离氨基酸混合物采用离子交换色谱或RP-HPLC进行分离，然后根据洗脱时间进行鉴定，根据峰面积或峰高进行定量测定。为增加分析的灵敏度，可以采用丹磺酰氯（dansylchloride）、Edman试齐J（PITC）、邻苯二醛（OPA）及2-疏基乙醇等试剂对氨基酸进行柱前或柱后衍生化，形成具有强荧光性的加成化合物之后进行检测，如本章10.1节所述。肽段氨基酸序列的测定肽和蛋白质序列测定（Prote

16、inSequencing）直接测序策略的步骤通常包括：第一，采用化学法或酶法从蛋白质多肽链的N端或C端将氨基酸残基依次从蛋白质或多肽的末端切割下来；第二，对每次切割下来的氨基酸残基进行正确的鉴定，氨基酸残基的鉴定通常采用在氨基酸残基上衍生一个生色基团，利用高效液相色谱法进行分离鉴定。随着生物质谱法、自动化技术和生物信息学的不断发展，尤其是生物质谱法中生物分子的电离技术的改进，使蛋白质序列测定技术已经发生了革命性的变化，蛋白质序列分析的时间大大缩短。N-端序列分析（Edman降解）Edman降解分析原理蛋白质和多肽的N端分析可通过与丹磺酰氯（dansylchloride）、氨肽酶（aminope

17、ptidase）或Edman试剂（异硫氧酸苯酯，phenylisothiocyanate,PITC）的反应进行分析。其中，1950年由P.Edman公布的氨基酸序列测定技术，即运用苯异硫氰酸酯与氨基酸的反应（Edman反应）进行N端分析特别有用。该技术采用每次从蛋白质的N端解离和鉴定一个氨基酸残基的方法，是蛋白质序列分析革命化的一项技术。目前，整个测序过程都可通过测序仪自动进行。Edman降解测序主要包括式（10.24）中耦联、裂解、萃取和转换等4个过程。tlm|. i畜aI：HT里：:d F.III R“FIT(10.24)的温和碱性条件下与蛋白质和多肽N端的自由竹氨基发生耦PTC-肽。PT

18、C-肽在无水三氟乙酸等强酸条件下裂解，通过选首先采用苯异硫氧酸酯（PITC）在pH9.0合反应，形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，即择性地切断N-端氨基酸残基肽键，释放出该氨基酸残基的曝睫琳酮苯胺衍生物，由此暴露出相邻的第二个氨基酸残基上的自由纺氨基，则可与PITC继续发生耦合反应。用氯丁烷等有机溶剂从反应液中将曝座琳酮衍生物选择性地萃取出来，去掉了一个N-端氨基酸残基的肽未被萃取将仍然保留在溶液中。由于曝唾琳酮苯胺衍生物的不稳定性，在萃取出来之后，于25%的三氟乙酸水溶液中转化为稳定的苯乙内酰硫月尿（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸。减少了一个氨基酸残基的肽保留在溶液中，再不断重复进行上述反

19、应过程，每一循环都得到一个PTH-氨基酸，采用色谱或电泳的方法对PTH-氨基酸与其它组分进行分离后，对包含在PTH衍生物中的氨基酸即可采用色谱或质谱等分析方法进行鉴定。Edman降解的最大优点是在水解除去末端标记的氨基酸残基时，不会破坏余下的多肽链。当蛋白质中含有一个或多个半胱氨酸残基时，有时一对半胱氨酸残基会通过二硫键发生交联，在这种情况下进行测序时，首先要对二硫键进行裂解处理（如用过甲酸处理）,然后再进行Edman降解测序。.影响Edman降解反应裂解率的因素如果样品具有足够的纯度，在测序完成后，根据每个循环的产率得出起始产率（initialyield）,起始产率可以估计蛋白质的真实含量，

20、与氨基酸组成分析得到的含量相比，还可以推测N端是否封闭；而根据每个循环的产率得出的重复产率（repetitiveyield）可判断仪器是否正常运行。目前，对一般蛋白质的分析最多能够分析至N端第50个氨基酸左右，而对蛋白质全序列的分析，首先需要将蛋白质裂解为一系列肽段，对各个肽段进行分析后再拼接。这是因为在经过多次循环后，Edman反应在其耦联、裂解、转换等过程发生的副反应使PTH-氨基酸的分析谱中将出现较多的杂峰，影响正确辨认。当蛋白质样品中含有较多的对Edman反应敏感的残基或肽键时，由于这些肽键容易发生断裂，从而得到的裂解率将会更低。三氟乙酸的作用是构成强酸条件并裂解PTC-肽，但是三氟乙

21、酸也可与Ser和Thr上的羟基发生反应，使Ser和Thr的N端”-氨基发生部分封闭。因此，当反应循环至Ser和Thr时，裂解产率会突然降低。丝氨酸和苏氨酸的PTH衍生物由于会部分转化为其他产物，也会导致产率降低。止匕外，耦联试剂PITC所发生副反应也会正确辨认产生影响。Edman降解法可在全自动测序装置中完成。在全自动测序仪的反应杯中，蛋白质键合于固相基质上或吸附于惰性玻璃纤维上而被固定，通过泵系统注入反应试剂，同时也通过泵系统控制反应试剂的量，Edman降解反应产生的曝唾琳酮衍生物被输送进入反应杯，再经过水解生成PTH-氨基酸，含有50个氨基酸残基的蛋白质序列可在1小时内完成测定，在蛋白质的

22、量低至pmol时也能够得到准确的分析结果。在Merrifield树脂固相基质上进行的Edman降解反应情况如式（10.25）所示，通过共价键合将肽片段固定于高分子聚合物薄膜上或微米大小的珠粒上，当固相基质浸入液相之后，依次加入所需要的反应试剂，进行Edman降解反应并移出反应产物进行分析。百技F如3脾解至宪点所打规基忸的S析(10.25)在气相序列分析中，常用四级镂盐聚合物polybrene作为载体材料，蛋白质或多肽样品通过肽链中极性基团的作用（非共价键合）而固定在化学惰性的玻璃纤维膜上，反应试剂通过瀛气流载人并引入到玻璃纤维膜上，通过色谱方法对自动移出的反应产物进行在线检测。由于该方法采用非

23、共价键合固定蛋白质或多肽样品，可在酸性或碱性溶液中防止蛋白质在萃取时发生损失。C端序列分析C端序列分析方法是对Edman降解法的一种有益的补充，它适合于N端封闭的肽和蛋白质的测序，DNA序列数据数据的确认，寡核甘酸探针的设计以及重组蛋白产物的质量控制等方面。1.C端分析原理竣肽酶作为一种肽链外切酶，可用于多肽的C端残基的切割，能够应用于蛋白质和多肽的C端分析，但是不同类型的竣肽酶对个别氨基酸残基具有不同的选择性，因而在切割过程中，某些氨基酸残基由于比较稳定或切割速度很慢，从而使竣肽酶的应用不尽完美（10.27）是用竣肽酶引发的C-端残基的裂解。NH %T：HNH惬NH3%多忧CH一仃NH；(1

24、0.26)0IIHN CH-C-HN0IICH-C-HN-CH-(?-97%以上）。因此，在测定序列之前，必须对样品进行纯度鉴定，N-端测序本品和C-端测序样品的纯度鉴定方法基本相同，如反相HPLC、SDS、毛细管电泳、阴离子或阳离子的FPLC等鉴定方法，并可采用多种互补有效的手段对样品的纯度进行鉴定。脱盐脱盐过程中采用的试剂、仪器必须是测序级的，才能保证脱盐完全，避免引入新的杂质。凝胶过滤、透析、超滤、反相HPLC等均可作为脱盐的有效方法。Perkin-Elmer公司推出的ProSpin装置，十分适合对蛋白质含量少的N-端测序样品的脱盐处理，它采用ProBlottPVDF膜与分子质量3000

25、Da截留过滤膜，通过离心方式除去样品中的缓冲盐、去垢剂及其他小分子杂质。而对C端测序样品的脱盐，则普遍采用结构和操作方法与ProSpin类似的ProSorb装置。巯基修饰方法N端测序样品和C端测序样品的巯基修饰方法基本相同，主要包括丙烯酰胺修饰和4-乙烯吡啶修饰两种方法。丙烯酰胺修饰31还原用1015110.2molL-1Tris,pH值为8.4,含有100mmolL-1DTT的缓冲液中溶解蛋白质样品，并加入SDS并使其最终浓度为1%,于70c水浴中保温2030分钟后，再用4倍体积重蒸水稀释。烷基化加入6molL-1丙烯酰胺浓溶液并控制其最终浓度为2molL-1，通入氩气或高纯度氮气，于37避

26、光保温3060分钟。脱盐加入甲醇至最终浓度为10%，再用ProSpin装置或其他有效脱盐方法进行脱盐。采用ProSpin装置进行脱盐的操作步骤：先用10甲醇润湿ProSpin上的ProBlottPVDF膜，加入反应溶液并离心，至膜上面无液体时加入50g20%甲醇，再次进行离心，切割下膜片并放入1.5ml离心管中，用0.1%TFA清洗膜片，再用水漂洗，待其自然晾干后或用氮气吹干后，即可进行序列分析。乙烯吡啶修饰32还原于40履100mmolL-1Tris,pH值为8.4,含有6molL-1盐酸服的缓冲液中溶解蛋白质，加入1molL-1dtt浓溶液并使其最终浓度为20mmolL-1,充入瀛气，于室

27、温放置12小时。烷基化加入2屋4乙烯叱咤，充分混合，于室温保温12小时。脱盐按1：1比例加入重蒸水稀释蛋白质溶液，然后用ProSpin装置或其他脱盐方法进行脱盐。N端封闭基团的去除33对使蛋白质和多肽的N端发生封闭的一些基团，可采用下述方法去除。去除N-乙酰丝氨酸和N-乙酰苏氨酸残基蛋白质吸附在PVDF膜上，经过蛋白质N端序列分析几个循环后，未能检测出N端氨基酸残基，将膜条置于1.5ml的塑料离心管中。加入50氟乙酸液体后密封管口并在40c保温1小时。打开管盖，在通风橱中使TFA完全挥发。将此膜条再放回序列仪中进行分析。去除N端甲酰甲硫氨酸中的甲酰基将吸附了蛋白质的PVDF膜条置于1.5ml的

28、塑料离心管中。加入30&0.6molL-1HCl后密封管口并在25c保温24小时。打开管盖，吸去HCl溶液，再将膜条真空干燥或氮气吹干。将此膜条再放回序列仪中进行分析。去除N端的焦谷氨酸将吸附了蛋白质的PVDF膜条置于1.5ml的塑料离心管中，加入1.2ml0.5%（m/V）PVP-40（溶于100mmolL-1冰醋酸中）封闭膜条，使其不再吸附其他蛋白质ml，于37保温30分钟，然后用超纯水清洗膜条至少5遍，再用0.5ml酶解缓冲液漂洗一遍。加入100R左右焦谷氨酸水解酶（5“g酶溶于100&50mmolL-1,pH7.0磷酸钠及10mmolL-1dtt缓冲液中），于37c保温510小时。膜条

29、用超纯水漂洗，自然吹干后放回序列仪中。去除N-乙酰基封闭的氨基酸残基将吸附了蛋白质的PVDF膜条置于1.5ml的塑料离心管中，用0.5%PVP-40封闭膜条以防止吸附蛋白酶。将膜用超纯水充分清洗后，加入510“g胰蛋白酶（溶于100代0.1molL-1碳酸氢镂，pH8.0,内含10%乙腈），于37酶解24小时。将离心管中的溶液移至另一干净的离心管中，用100m超纯水清洗膜条后，将此清洗液与酶解后的溶液合并，然后此含有酶解多肽的溶液冷冻干燥。加入100650%比咤及10R异硫氧酸苯酯（PITC）,通入氮气20秒，然后于60c保温1小时。此步骤中PITC可以和除N端被乙酰基封闭的多肽以外的酶解后的各个多肽的N端”-氨基反应。加入50g蒸/乙酸乙酯（1：1体积比）混合溶剂，充分振荡后以3000g离心1分钟。吸去含有过量试剂及反应副产物的上层溶液，再按照对下层溶液抽提3次，然后真空干燥下层溶液。加入100g过甲酸（9份甲酸与1份过氧化氢混合后室温放置1小时），于0c保温1小时，以封闭经过上述几步反应的多肽的N端。真空抽干，再用水溶解，然后再将样品抽干。将多肽用100110.2mmolL-1,pH7.2磷酸缓冲液（含1mmolL-1dtt）溶解，加入0.05单位的N-乙酰氨基酸去除酶（AARE），于37保温1