SNP单核苷酸多态性检测技术

1、1定义：单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换

2、、缺失和插入。所谓转换是指同型碱基之间的转换,如嘌呤与嘌呤(G2A)、嘧啶与嘧啶(T2C)间的替换;所谓颠换是指发生在嘌吟与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T)之间的替换。从理论上来看每一个SNP位点都可以有4种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2：1oSNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T，原因是CG中的C常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言，SNP是指变异频率大于1%的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP总量大概是3X106个。依据排列组合原理,SNP共可以有6种替换情况，即A/G、A

3、/T、A/C、C/G、C/T和G/T,但事实上，转换的发生频率占多数,而且是C2T转换为主，其原因是CpG的C是甲基化的，容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T,CpG也因此变为突变热点。理论上讲,SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。这种变异可能是转换（CT,在其互补链上则为GA），也可能是颠换（CA，GT，CG，AT）。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3,其它几种变异的发生几率相似。Wang等的研究也证明了这一点。转换的几率高，可能是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶残

4、基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。SNP在动物基因组中分布广泛,每一个核苷酸发生突变的概率大约为10-9。由于选择压力,SNP在单个基因、整个基因组中以及种群间的分布是不均匀的。SNP在非编码区中要多于编码区,而且在编码区也是非同义突变（有氨基酸序列的改变）的频率比其他方式突变的频率低得多4。而基因间,同一种基因中的编码SNP（codingSNP,cSNP）的数目也不相同，可从029个不等。多项研究同时发现不同种族间SNPs的数目也是不同的,非洲人群及非裔种族中SNPs数量最多,而其他种群的SNPs要少得多,因此通过比较亚群间等位基因的频

5、率将有助于阐明种族的结构和进化。在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP（codingSNP,cSNP）比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5.但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是同义cSNP(synonymouscSNP)，即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP(non-synonymouscSNP)，指碱基序

6、列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。cSNP中约有一半为非同义cSNP。先形成的SNP在人群中常有更高的频率，后形成的SNP所占的比率较低。各地各民族人群中特定SNP并非一定都存在，其所占比率也不尽相同，但大约有85%应是共通的。2.SNP自身的特性：SNP数量多，分布广泛。据估计，人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP，人类30亿碱基中共有300万以上的SNPs.SNP遍布于整个人类基因组中，根据SNP在基因中的位置，可分为基因编码区SNPs(Coding-regionSNPs，cSNPs)、基因周边SNPs(

7、PerigenicSNPs，pSNPs)以及基因间SNPs(IntergenicSNPs，iSNPs)等三类。SNP适于快速、规模化筛查。组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基因（biallelic）。由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这就利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。3）SNP等位基因频率的容易估计。采用混和样本估算等位基因的频率是种高效快速的策略。该策略的原理是：首先选择参考样本制作标准曲线，然后将待测的混和样本与标准曲线进行比较，根据所得信号的比例确定混和样本中各种

8、等位基因的频率。4）易于基因分型。SNPs的二态性，也有利于对其进行基因分型。对SNP进行基因分型包括三方面的内容：（1）鉴别基因型所采用的化学反应，常用的技术手段包括：DNA分子杂交、引物延伸、等位基因特异的寡核苷酸连接反应、侧翼探针切割反应以及基于这些方法的变通技术；（2）完成这些化学反应所采用的模式，包括液相反应固相支持物上进行的反应以及二者皆有的反应。（3）化学反应结束后，需要应用生物技术系统检测反应结果。绝大多数疾病的发生与环境因素和遗传因素的综合作用有关，通常认为是在个体具有遗传易感性的基础上，环境有害因素作用而导致疾病。不同群体和个体对疾病的易感性、抵抗性以及其他生物学性状（如对

9、药物的反应性等）有差别，其遗传学基础是人类基因组DNA序列的变异性，其中最常见的是SNP.易感基因的特点是基因的变异本身并不直接导致疾病的发生，而只造成机体患病的潜在危险性增加，一旦外界有害因素介入，即可导致疾病发生。另外在药物治疗中，易感基因的变异造成药物对机体的疗效和副作用不同。随着人类基因组计划的进展，人们愈来愈相信基因组中的SNP有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。因此，寻找和研究SNP已成为人类基因组计划的内容和目标之一。1、多态性是一个群体概念，多态性指这个差异占群体的1%以上。否则就叫突变（小于1%）2

10、、SNP是多态性中的一种，只是进一步限定了差异只是单碱基。3、SNP一般来说，是全部体细胞一样的基因型（除开嵌合体）。4、突变一般不是一个个体全部细胞的变化。5、如果突变发生在生殖细胞，则可以遗传，但是只要这个突变群没有达到总群体的1%，它就只是一个突变株/系。达到了1%就是多态性了。常用数据库:HumanGeneMutationDatabase(HGMD)/ HYPERLINK http:/www.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html http:/www.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html/TheGenomeDatabase(GD)/Databa

11、seofSingleNuleotidePolymorphisms(dbSNP)/ HYPERLINK /SNP/ /SNP/HumanGenomeVariationDatabase(HGVbase)/http:/hgvbase.cgb.ki.se/TheSnpConsortium，LTD.(TSC)/3.SNP现有检测技术人们对SNP的研究方法进行了许多探索和改进。SNP分析技术按其研究对象主要分为两大类,即:对未知SNP进行分析,即找寻未知的SNP或确定某一未知SNP与某遗传病的关系。检测未知SNP有许多种方法可以使用,如温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、单链构象多

12、态性(SSCP)、变性的高效液相色谱检测(DHPLC)、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)等,但这些方法只能发现含有SNP的DNA链,不能确知突变的位置和碱基类别,要想做到这一点,必须对那些含有SNP的DNA链进行测序。对已知SNP进行分析,即对不同群体SNP遗传多样性检测或在临床上对已知致病基因的遗传病进行基因诊断。筛查已知SNP的方法有等位基因特异寡核苷酸片段分析(ASO)、突变错配扩增检验(MAMA)、基因芯片技术(genechips)等。由于人类基因工程的带动,许多物种都已开始了基因组的项目,并建立了大量数据库,比较这些来自不同实验室不同个体的序列,就可

13、以检测到SNP。SNP位点信息已知的情况下，选择SNP的GENOTYPING的方法，主要根据你的经费情况设计，我分别给你分析一下现状：A、一般实验室：经费一般，仪器不具备时，最多用的是以下两种方法：1、基于PCR的方法，也叫AS-PCR,(ALLELE-SPECIFICPCR)的办法。主要原理是利用引物在扩增时3端相对高的BASE要求，进行设计。这个方法是最便宜的，不需要酶切，一次PCR就可以得到GENOTYPING的信息。缺点：PCR对于3端的特异性在不同退火温度时有出入，所以退火温度的摸索很关键，否则假阳性扩增是很容易的。另外，内参照的设置也很重要，这个东西还是很有意思的。而且，所使用的引

14、物位置无法人为调整，只能放在SNP的5段。2、基于酶切分型。依靠限制性内切酶的忠贞性进行单SNP的分型。SNP突变与否，可能影响某个酶识别位点的存在或消失。通过酶切产物的电泳条带，判断SNP的突变的情况，即纯和，野生纯和,和杂和子。当没有直接可利用的酶切位点时，可以采用突变引物中个别BASE,从而凑成切点的设计，也叫做RG-PCR，restrictionsitegenerationPCR。B、有经费的实验室的方法：这里我写几个自己曾经涉足过的方法，可行性比较强，但是需要相应的经费支持和相应的仪器，但是通量相对更高，效率更好：1、直接测序，基于PCR产物的直接sequencing的方法，比对序列

15、结果，就可以进行SNP的识别和分析。2、分型质谱，华大生物信息平台那边可以外接服务，提供PCR产物即可。3、pyro-sequencing，微测序，中科院遗传所王沥研究员那里有可以联系的外接服务。4、D-HPLC，变性高效液相色谱法。北京可以去联系做的地方不少，北京大学生科院有机器，另外北京大学肿瘤研究所也有机器，国家人类基因组陈标那里也有一台，需要做的话，拿着经费和他们联系就可以，这个方法也很不错，价钱可以商量。5、还有些方法，如DNA芯片技术适合对于largescale的SNP的筛查，一般用于组学领域，可能不适用与您的情况。还有许多如荧光共振能量转移等方法/探针杂交法等，并未在本领域中国内

16、推广，就不一一介绍了。1）测序主要发现新的SNP位点和比较集中的SNP位点，如hla区域，但成本较高，工作量大，不适合大样本做疾病关联分析。2)taqman探针结果比较可靠，国外文章也大量应用，不过对于国内成本偏高，同类还有snpshot技术，abi和贝克曼都相应试剂盒。成本和成功率都比taqman要低。3)snp芯片国外大规模筛查疾病关联分析常用，illumina和affy都有不同密度的成熟产品，单位点成本很低，但点较多，样本多时也会很高花费，但结果准确，适合复杂疾病，有实力的项目组一般大型机器点在384-群基因组可以订制，但成本会高；illumina开发了一台小的芯片，极其适合1-384，

17、可以订制，成本在2-5元/人点，但还没有很成熟的流程，具体效果和成功率要进一步看。4)剩下的就是传统方法如酶切，PCR-SSCP等，也有杂志接受，但一般需要测序验证。缺点是工作量太大，结果不准确，不是所有位点都可以做，但成本很低。目前已有多种方法可用于SNP检测，如根据DNA列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及TaqMan系统等。但不管哪一种方法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其它检测。传统的SNP检测方法是采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO

18、)等。这些技术虽在某种程度上能完成对SNP的检测，但由于它们必须通过凝胶电泳进行检测，因此，距快速、高效、自动化的目标还相差甚远。传统的RFLP只能检测到SNP的一部分，测序技术既费时费力，又不易实现自动化，而且DNA链的二级结构还容易造成人工假相，使测序结果出现偏差，不适宜于SNP的检测；SSCP则很难满足自动化的需要，难以大规模开展工作。因此，这些方法均未被广泛采用。DNA芯片技术是近年来新开发的一种DNA序列变异检测工具。DNA芯片(DNAchip),也称生物芯片(biochip),其大小与计算机上的CPU芯片相似，约1cm2或更大些，以玻璃、硅、聚丙烯等作为载体基片，芯片上铺了一层肉眼

19、看不见的DNA纤维“地毯”，即具有特定碱基序列的探针。待测基因经提取后，被切成长短不一的片段，经荧光化学物质标记后，注射到嵌有芯片的载片上。由于DNA和探针杂交的程度与荧光强度相关，因此通过激光扫描，即可根据荧光强弱测出被检测序列的变异。目前已有多家公司开展了对芯片的研究，例如美国的Affymetrix公司、NEN生命科学公司等。前者曾开发出BRCA1(乳癌基因1号)芯片、p53芯片等，后者则在1张玻璃芯片上集成了多达2400个已知基因。此外，ResearchGenetics公司新近开发了1个集成有1500个SNP的DNA芯片，它涵盖了人类基因组全部24条染色体，所提供的信息量至少等于或优于目

20、前常用的300400个微卫星标记的图谱，检测时只需0.5建的DNA样品就可进行1次全基因组的扫描。另外Transgenomic公司的WAVE核苷酸片段分析系统是高通量且较为准确可靠的筛查未知、已知SNP的新方法。利用Transgenomic公司的WAVE核苷酸片段分析系统进行SNP检测平均每个样本的费用为$0.5。当前SNP功能研究主要有以下几方面：SNP的分型技术可分为两个时代，一为凝胶时代，二为高通量时代。凝胶时代的主要技术和方法包括限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP）、寡核苷酸连接分析（OLA）、等位基因特异聚合酶链反应分析（AS2PCR）、单链构象多态性分析（SSCP）、变性梯度凝

21、胶电泳分析（DGGE），虽然这些技术与高通量时代的技术原理大致一样，但是由于它不能进行自动化，只能进行小规模的SNP分型测试，所以必然会被淘汰。高通量时代的SNP分型技术按其技术原理可分为:特异位点杂交（ASH）、特异位点引物延伸（ASPE）、单碱基延伸（SBCE）、特异位点切割（ASC）和特异位点连接（ASL）5种方法。此外，采用特殊的质谱法和高效液相层析法也可以大规模、快速检出SNP或进行SNP的初筛。近年来已经在晶体上用“光刻法”实现原位合成，直接合成高密度的可控序列寡核苷酸，使DNA芯片法显示出强大威力，对SNP的检测可以自动化、批量化，并已在建立SNP图谱方面投入实际应用。DNA芯片

22、法有望在片刻之间评价整个人类基因组。报告基因转染技术:这一技术主要用于研究启动子SNP对于mRNA转录效率，是通过观察转录结局来判断SNP是否具有功能。EMSA技术：通过在体外合成含SNP位点的寡核苷酸与转录因子特异性结合，观察结合的强度和效率,但是该技术由于只人工合成较短长度的寡核苷酸，没有考虑SNP周围遗传背景环境的影响,因此在重复性和说服力上不强。ChiP技术：该技术通过超声将染色体碎片化,再将碎片化的核酸与转录因子的结合，最后通过PCR技术观察判断结合的效率和强度，该技术克服了EMSA的一些缺点,当前做的文献较多。5SNP产生功能的机制研究的个人之所见对大多数SNP而言，都由于位于一些

23、非编码区域而不产生明显的功能性影响，此时做SNP功能意义不大。启动子SNP研究是做的人最多的，相关实验技术都比较成熟，其产生功能的机制主要是影响TF与启动子的的结合能力，从而调控基因的转录。编码区SNP有同义和非同义2种，非同义突变由于会导致氨基酸的变化，从而影响蛋白质的功能，特别是发生在结构功能区域的SNP尤其重要，可是这方面的技术还存在瓶颈，做得相当少，据我所知要用什么诱导点突变的方法再去评价蛋白质功能的。至于非同义突变，虽然没有明显的功能的分子机制，但是在遗传学上可能因为与附近的其它致病基因的表达或者SNP连锁，因此在流行病学上形成阳性结果一般以此解释。4.内含子区域SNP产生功能的分子

24、机制一般是与附近其它基因SNP连锁或者可能影响mRNA的剪接从而影响蛋白质的功能很多研究中做INTRON发现有阳性结果解释不了，而且大多只是猜测。PYRO测序用于SNP基因分型其实是一种段片段焦磷酸测序技术，在测序引物的引导下，完成段片段（含snp）的测序，从而实现基因分型。缺点：不能检测长片段，对于重复序列没有办法。原理简介测序引物与单链，PCR扩增的DNA模板相结合。然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，以及底物APS和荧光素一起孵育。四种dNTP之一被加入反应体系，如与模扳配对，此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。而且

25、释放出来的Ppi的量与和模板结合的dNTP的量成正比。ATPsulfurylase在adenosine5phosphosulfate存在的情况下催化PPi形成ATP，ATP驱动luciferase介导的Luciferin向oxyluciferin的转化，oxyluciferin发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。TP和未掺入的dNTP由Apyrase降解，淬灭光信号，并再生反应体系。然后加入下一种dNTP。最终待测序列顺序，即可从反应光强的信号峰中读出。在此过程之中有几点值得注意的是，在体系中使

26、用的是dATPS而非dATP，因为dATPS不是荧光素酶的底物，而且DNA聚合酶对dATPS的催化效率更高。而且在系统之中，底物的浓度已经最佳化，使得dNTP的降解速度慢于它的掺入速度，ATP的合成速度快于水解速度，其中三磷酸腺苷双磷酸酶的特异浓度，可以保证降解完全，使系统复原。RealtimePCR检测SNP的方法是：针对目标基因片段的突变位点，设计两条引物，这两条引物的区别仅仅是末端的1-2个碱基不同，分别与突变位点匹配。共同的下游引物和探针。然后扩增。就可以得到不同的CT值，根据CT值的不同，来确定基因类型。1、把蛋白序列对应的核酸序列找到。2、根据核酸序列做BLAST(对dbSNP数据

27、库 HYPERLINK /SNP/snpblastByChr.html)%e3%80%82 /SNP/snpblastByChr.html)。3、结果中，可以得到你的序列上所以已知的SNP。以编码5-hydroxytryptamine(serotonin)receptor的HTR1A基因为例，先进入entrez,选择gene选项，在NCBI中搜HTR1A基因，到如下图界面，点基因缩略图，然后点graphics。点击后的界面如下。这里已经很清楚地标明了SNP所在的位置以及对应的核酸与蛋白序列。但有一点要说明，我注意到这个基因编码的蛋白序列与swissprot的序列有一些差别，很可能是收录的版本不

28、同,或是有些序列是NCBI直接根据orf形成的.1,如果是检测基因的所有已知的SNP,那么首先要去了解并查询到这些SNP位点，SNP位点可以通过查询dbSNP数据库( HYPERLINK /SNP/)%e5%92%8c /SNP/)和TSC(TheSNPConsortium)数据库(/)，可以获知基因及上下游邻近序列的SNP位点。2，至于挑选的原则，可以介绍一下HapMap的正规化标准：SNPSelectionCriteriaCategory1verifiedThiscontainsallSNPsforwhichwehaveallelefrequencyorgenotypingdata.Thi

29、sincludesSNPsfromtheTSCallelefrequencyproject,aswellasSNPscharacterizedbyJSNP.TheseSNPsweregeneratedfromthosersclustersinwhichatleastoneoftheSNPsintheclustercontainsgenotypeorallelefrequencydataandtheminorallelemusthavebeenseeninatleasttwoindividuals.Category2two-hitThesearetruedouble-hitSNPs,produc

30、edincollaborationwithJimMullikinandSarahHunt.Adouble-hitSNPmustbeseentwice,intwodifferentDNAsampleswhichmusthaveproducedtwoalleles.TSCtracedatawasonlyallowedtocontributeonehitperallelebecausetheindividualsourceDNAforatracecouldnotbeidentified.Category3jsnp-verified/perlegen-verified”Thiscategorycont

31、ainstwogroups:SNPsthatJSNPcertifiesarelikelytoberealbasedonmanualinspectionoftheirdata(buthavenotbeengenotyped)，andSNPsthatPerlegenverifiedindependently.Category4bac-overlapTheseareSNPsfromBACoverlapsthatdonotfallintocategory1or2above基因芯片与SNP分析基因芯片技术作为一种新兴的生物技术，近年来得到迅速发展，其应用具有巨大的潜力。单核苷酸多态性（SNP）作为新的遗

32、传标记对基因定位及相关疾病研究的意义亦非常重大。本文主要介绍了DNA芯片技术的原理和分类、单核苷酸多态性检测方法及DNA芯片技术在单核苷酸多态性检测方面的应用。生物芯片技术是90年代初发展起来的，集分子生物学、微电子技术、高分子化学合成技术和计算机科学等于一身的一门新型技术。目前发展的生物芯片种类繁多，如蛋白质芯片、基因芯片、激素芯片、药物芯片等。但最初的生物芯片主要用于对DNA的测序，基因表达谱的鉴定及基因突变体的检测、分析等方面。迄今为止，使用最多的也是DNA芯片。DNA水平遗传多态性标记至今已经历了3个阶段:限制性酶切片段长度多态性标记（RFLP）、DNA重复序列的多态性标记（包括小卫星

33、、微卫星DNA重复序列）、单核苷酸多态性标记（singlenucleotidepolymorphisms，SNPs）。SNP具有数量多，分布广泛，易于快速、规模化筛查，便于基因分型等特点。伴随着SNP检测和分析技术的进一步发展，尤其是与DNA芯片等技术的结合，SNPs在基因定位中具有巨大优势和潜力，并为dn芯片应用于遗传作图提供了基础。由于基因芯片具有携带信息量大和检测方便的特点，使得用DNA芯片对SNP进行分析具有广阔的前景。DNA芯片和SNP分析已日益成为研究功能基因组学的工具。1、基因芯片基因芯片的基本原理是应用已知的核苷酸序列作为探针与标记的靶核苷酸序列进行杂交，通过对信号的检测进行定

34、性与定量分析。基因芯片可在一微小的基片（硅片、玻片等）表面集成大量的分子识别探针，能够在同一时间内平行分析大量基因，进行大信息量的检测分析。基因芯片应用很广，根据所用探针类型不同分为cDNA微阵列（或cDNA微阵列芯片）和寡核苷酸阵列（或芯片），根据应用领域不同而制备的专用芯片如毒理学芯片（toxchip）、病毒检测芯片（如肝炎病毒检测芯片）、p53基因检测芯片等。根据其作用可分为检测基因质和量的芯片。量的检测包括:检测mRNA水平、病原体的有无及比较基因组基因的拷贝数，既可用寡核苷酸芯片，又可用cDNA芯片完成，但cDNA芯片更具优势。质的检测包括:DNA测序及再测序、基因突变和SNP检测等

35、，主要用寡核苷酸芯片完成。巢式PCR-RFLP技术巢式PCR-RFLP是针对任意的基因分型技术，使任何位点最终都能进行常规限制性内切酶鉴定；同时该SNP分型技术利用巢式PCR技术，使得多个位点同时进行分析成为可能。即使低浓度的DNA也能够进行快速准确的分型工作。与现有常规的分型技术相比，其最大的优势包括：（一）所需DNA浓度低。l-2ng/uL也能完成检测工作，而Taqman技术所需的DNA含量至少5ng/uL。（二）价格低。由于不需要合成荧光探针，使得该技术比Taqman技术价格低，该优势在对多个位点同时进行分型时更明显。技术基本原理和实例采用的巢式PCR-RFLP分型技术，其基本原来是利用

36、PCR引物的3,端，对SNP位点附近的碱基进行人为改造，产生一个常规的限制性内切酶识别序列，如SNPrsl321425（rsl321425来自NCBI的refSNP数据库）的C/G,其任何一个碱基和上下游碱基无法形成一个可直接被限制性内切酶识别的序列，于是我们对SNP位点前的上游碱基进行改造，通过对序列的分析和PCR效果的计算，我们将原本四个碱基AGAT改成CTGC，结合后一个碱基A以及SNP位点G,形成CTGCAG（PstI）酶切识别位点，经测序和序列对比，改造成功。又比如rs9309462和rs4646642,成功的将2个碱基，3个碱基进行成功的改造。rs1321425TCACAAAAAA

37、TAAAAAATTTTAATTTTAAAGGAGATAC/GACAAGAAATGAGCATGTGTGAAAGCACTTCTGTAAACTACATGCACTAAT与Taqman技术和普通技术的详细对比分型技术PCR-RFLP技术Taqman技术普通PCR-RFLP技术最佳运用时机200-600样本，任何DNA多态位点样本量大于500人份仅适合含有现成酶切位点的多态位点的分型试剂投入低荧光探针，需3000-4000元。有可能实验失败需重新花钱设计荧光探针。低技术的适用性可适合任何多态位点的分型基本适合任何多态位点的分型，但有时若干位点不能成功进行试验；当分型位点过于接近也不能用该方法。仅适合含有现

38、成酶切位点的多态位点的分型，有时出现的是一些稀有酶的酶切位点，导致效率低下或费用昂贵；结果判断直观，明确，稳定间接，每管反应必须加荧光参照ROX，否则结果判断不确定一般直观，明确；有时酶切位点出现在非主频等位基因上，导致结果判读困难结果稳定性稳定一般稳定结果准确性准确度高一般准确度高样本消耗量1-2ng5-10ng50100ng实验耗时2-3周由于要定制MGB荧光探针，和预实验，也需要2-3周2-3周操作流程1基本信息收集具体内容包括客户信息、样本数case,control）数、位点信息等。2位点信息的查询主要包括：2.1位点上下游各300bp的确切序列，基因频度;2.2有无文献报道证明该位点

39、多态存在于中国人群;2.3如无上述相关文献，在J-SNP数据库中查询该位点多态是否存在于东亚人群中。为了保证结果的可靠，实验方案设计原则上应以野生型进行酶切鉴定，因此确认snp的频度是非常重要的。3样品质控从全部样品中取8%样品，即96个样品中取8个样品，用我们的一对特异的PCR引物进行样品质控，以检测送来样品是否良好。因为客户样品质量是实验成功的关键因素之一，只有客户提供的样品质量可靠稳定，那么结果自然就好。4引物设计同时设计AB两套方案，分别以正链和负链为模板设计引物。5单管测试进行实验方案可行性尝试，首先要在多种温度，多种Mg离子、多种添加剂加入的情况下进行方案的可行性测试，对于所有单管

40、测试的结果都送去测序，以保证序列的正确性，在实验结果得到确认的基础上，挑选稳定的方案进入中试过程。6中试抽取8个样品做小规模批量实验，以模拟和检查批量PCR情况和酶切情况。7.大规模实验准备将DNA模板按方案进行一次性分板（有冗余），并引入阳性和阴性对照，同时将所有相关的PCR体系进行一次性大规模分装，防止污染。8.第一板数据先用一板模板进行一轮PCR和酶切，以检验体系和分板的情况。9正式实验相关技术要点1实验设计必需保证野生型的被限制性内切酶切开因为对于只有少量突变型的SNP位点，如果突变型被切开，那么所得到的实验结果就是大量没有被酶切开的PCR产物，而这个结果与酶切实验失败的结果非常类似，

41、不易区分，对结果的判读造成很大的麻烦，因此保证了主频碱基被解开，从根本上保证了实验的可靠性。偏向性扩增的解决。所谓偏向性扩增是因为SNP位点上会往往存在嘌吟和嘧啶的替换，在PCR过程中，聚合反应对嘧啶（C或T）比较敏感，使得嘌吟（A或T）的扩增非常少，而出现偏向性扩增，这在SNP位点附近嘌吟含量较高时特别明显。为此，本公司专门设计一个方案，用以克服偏向性扩增。3方案设计中的内切酶的选择虽然从理论上，我们的方案可以进行任意位点改造，但事实上在改造过程中会出现一系列的问题，包括扩增效率，碱基划移等一系列问题，使得改造方案失败。对此，我们公司专业开发了一个引物设计软件，通过运算获得最佳的改造方案，同

42、时通过在正向和反向序列上同时设计方案，以保证试验的成功。4PCR产物的污染问题在大规模的PCR过程中，最严重的问题是PCR产物污染，据我们经验总结,80%以上的污染是由于接触式污染，剩余的污染则包括气溶胶污染等环境造成的污染。对于PCR污染这个问题，本公司制订了严格的实验措施，具体包括使用滤芯抢头、所有PCR体系全部分装、PCR体系与各类模板严格分离、配置体系人员与接触PCR产物人员严格分离等一系列措施，同时在处理PCR管,eppendorf管时也规定了详细的操作过程。5.关于质量控制问题在每板空过程中，我们会放入两个阴性对照和一个重复对照，以确认PCR的过程中不会产生污染和PCR的结果确实可

43、信。RFLP技术一、材料基因组DNA（大于50kb，分别来自不同的材料）。二、设备电泳仪及电泳槽，照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板（比胶块略大）4块，吸水纸若干，尼龙膜（依胶大小而定），滤纸，eppendorf管（0.5ml）若干。三、试剂：1、限制性内切酶（BamHI,EcoRI,Hindlll,XbaI）及10 x酶切缓冲液。2、5xTBE电泳缓冲液：配方见第一章。3、变性液：0.5mol/LNaOH,1.5mol/LNaCl。4、中和液：lmol/LTrisCl,pH7.5/1.5mol/LNaClo5、10 xSSC:配方见第九章。6、其它试剂：0.4mol/LNaOH,0.2mol/L

44、TrisCl,pH7.5/2xSSC,ddH2O,Agarose0.8%,0.25mol/LHClo操作步骤基因组DNA的酶解大片断DNA的提取详见基因组DNA提取实验，要求提取的DNA分子量大于50kb,没有降解。在50卩1反应体系中，进行酶切反应：5yg基因组DNA5卩110 x酶切缓冲液20单位(U)限制酶(任意一种)加ddH2O,至50卩1轻微振荡，离心,37C反应过夜。取5卩1反应液,0.8%琼脂糖电泳观察酶切是否彻底，这时不应有大于30kb的明显亮带出现。注意未酶切的DNA要防止发生降解，酶切反应一定要彻底。Southern转移(1)酶解的DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳(可18V过

45、夜)后EB染色观察。将凝胶块浸没于0.25mol/LHC1中脱嘌吟，10分钟。取出胶块,蒸馏水漂洗,转至变性液变性45分钟。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30分钟。预先将尼龙膜，滤纸浸入水中,再浸入10XSSC中，将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸(桥)然后将胶块反转放置，盖上尼龙膜，上覆二层滤纸，再加盖吸水纸，压上半公斤重物，以10XSSC盐溶液吸印，维持18-24小时。也可用电转移或真空转移。(5)取下尼龙膜，0.4mol/LNaOH30秒，迅速转至0.2mol/LTrisCl,pH7.5/2xSSC,溶液中，5分钟。(6)将膜夹于2层滤纸内，80C真空干燥2小时。(7)探针的制备和杂交见第九章分

46、子杂交部分。注意1、步骤(2)中脱嘌吟时间不能过长。2、除步骤(1)、(4)、(5)外，其余均在摇床上进行操作。3、步骤(4)中，当尼龙膜覆于胶上时，绝对防止胶与膜之间有气泡发生，加盖滤时也不应有气泡发生。4、有时用一种限制性内切酶不能发现RFLP的差异，这时应该试用另一种酶PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。一.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及活性PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除

47、净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值

48、，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或10

49、0ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。1假阳性出现的PCR扩增条带与目的

50、靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，

51、但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。2出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或

52、采用二温度点法（93C变性，65C左右退火与延伸）。3出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。二.PCR污染与对策PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。污染原因（一）标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交

53、叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。（二）PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.（三）PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量大（一般为1013拷贝/ml）,远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时

54、及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。污染的监测一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。本实验的关键步骤是获得适当的抗体-DNA复合物。用链亲和素将生物素标记的抗体与生物素标记的DNA偶

55、联的方法，因每个链亲和素分子可与四个生物素分子结合，因此要优化反应条件，以使得每个链亲和素分子既能结合上抗体分子，又能结合上DNA。此外，还可用化学方法将DNA与抗体分子共价偶联，即将抗体分子和5端氨基酸修饰的DNA分别用不同的双功能偶联剂激活,然后通过自发的反应偶联到一起，比如，用N-Succinimidyl-S-acetylthioacetate(SATA)活化氨基修饰的DNA，用Sulfo-Succinimidyl4-(maleimidomethyl)Cyclohexane-l-Carboxylate(Sulfo-SMCC)修饰抗体分子，然后将二者在一小管中混合，通过加入盐酸胲(Hydr

56、oxylaminehydrochloride)使二者偶联在一起。免疫PCR具有高敏感性。因此，抗体和标记DNA的任何非特异性结合均可导致严重的本底问题。因而在加入抗体和标记DNA后必须尽可能彻底地清洗。即使有些特异性结合的抗体或标记DNA被洗掉了，亦可在最后通过增加PCR的循环次数得到弥补。此外，应用有效的封闭剂对防止非特异性结合也是非常重要的。可用脱脂奶粉和牛血清白蛋白做蛋白封闭剂，用鱼精DNA做核酸封闭剂。防止本底信号的另一个重要因素是控制污染，这也是所有敏感的检测系统存在的问题。即使每一步试验都做得非常认真，重复使用同样的引物和标记DNA均会产生假阳性信号。免疫PCR的一个优点是标记DN

57、A序列完全是人为选定。因此标记DNA及其引物可经常变换，以避免由于污染造成的假阳性信号。免疫PCR可以检测到常规免疫学方法无法检测的样品。因此,应用免疫PCR可在微观水平(单细胞)检测抗原，定量PCR产物可以估计某一标本中的抗原数量，在临床诊断中可在疾病早期抗原量很低时检测到微量的抗原。(1)免疫PCR的优化策略一一新型连接分子的出现叶绿素分子和链酶卵白素乔生军等用自然界普遍存在的叶绿素分子(chlorophy)作为共价连接蛋白与核酸的中间分子，构建了甲胎蛋白(AFP)抗体的基因探针，此探针人为地把抗体直接锚定在双链DNA分子上，复合分子性质均一稳定，室温至少保存6个月，大大简化了中间步骤，降

58、低了成本，使免疫PCR更易推广。也有人用链酶卵白素将生物素化的抗体与生物素化的DNA分子直接连接，也得了良好的较果。双特异融合蛋白任军将编码单链抗体和链亲和素融合蛋白的基因插入载体在大肠杆菌中进行表达，获得了具备结合生物素和抗原分子的双特异性融合蛋白，可直接连接抗体和生物素化的DNA分子。该融合蛋白可利用工程菌大量制备，性质优良，价格低廉。生物素化F(abJ2段代替生物素化单抗抗体的Fab或F(abz)2易于标记，且因缺乏Fc段大大降低了非特异性吸附的可能性，使免疫PCR的本底大为降低。Yashito用胃蛋白酶消化单抗，把得到的Fab段用生物素标记，以此来检测ANP,使其特异性大为提高。(2)

59、免疫-PCR的改进虽然Sano等人构建的免疫-PCR具有极高的灵敏度，但Sano所用的连接分子链亲和素-蛋白A嵌合体还没有商品化，因此限制了它在实际应用中的广泛普及。Ruzicka等人以生物素化的抗体取代Sano免疫-PCR系统中的抗体，用商品化的亲和素代替链亲和素-蛋白A嵌合体作为连接分子构建了一个新的免疫-PCR系统。Ruzicka用此免疫-PCR系统检测小鼠抗载脂蛋白E抗体。可以检测出包被浓度为10fg/ml的E抗体。此外,Sano的免疫-PCR实验流程需要众多的洗涤步骤，使实验过程相当繁琐，并需要大量的操作时间。Zhou等人对此作了改进，他们用生物素化的二抗和游离链亲和素作为连接分子进

60、行免疫-PCR实验,把每个步骤的洗涤次数从原先的715次减至35次，从而减少了操作时间，但不影响实验结果的准确性。另外，用修饰过的抗原稀释缓冲液（modifiedantigendilutionbuffer,MADB）代替Sano免疫-PCR中的TBS作为抗原稀释液，它主要把TBS中胍的浓度调到2M,由此解决了抗原的溶解问题。Zhou检测了人原癌基因ETSI,检测浓度可达到96X10-15M,是常规ELISA的105倍。与Sano的免疫-PCR系统相比，Ruizicka和Zhou所用的方法不需要特殊的试剂，生物素和亲和素（链亲和素）都已经商品化，因此在实际操作中得到广泛应用。但直接包被待检抗原不