生物技术制药课件

1、生物技术制药第四章 动物细胞制药第一节 概述（1）发现细胞和创立细胞学说（1665年）（2）组织培养或细胞培养。1885年德国生理盐水培养鸡胚组织（3）细胞工程时代：基因工程的理论和技术，细胞融合的理论和技术，细胞核移植的理论和技术，染色体改造的理论和技术，转基因动、植物的理论和技术，细胞大量培养以及产物分离纯化的理论和技术。（4）细胞工程制药-现代制药技术中常用的手段。第二节 动物细胞的形态和特点一、动物细胞的形态细胞的分化（或特化）形态分化在离体培养同样也存在。离体培养的细胞分为两类：贴壁依赖型（anchorage-dependent）：贴壁细胞非贴壁依赖型（anchorage-indep

2、endent）：悬浮细胞。动物细胞结构图一、动物细胞的形态1、贴壁细胞生长要求供细胞贴附的支持物，贴附因子(来源细胞自身或培养基)。形态：成纤维样细胞：来源于中胚层组织的细胞，生长时呈放射状、旋涡状或火焰状走行；上皮样细胞：来源于外胚层和内胚层组织的细胞，生长时彼此紧密连接成单层细胞片。一、动物细胞的形态2、悬浮细胞细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养液中呈悬浮状态生长。3、兼性贴壁细胞兼具上述两种生长方式的细胞，称为兼性贴壁细胞。如CHO细胞、小鼠L929细胞。贴附在支持物表面上生长时呈上皮或成纤维细胞的形态，而当悬浮于培养基中生长时则呈圆形。二、动物细胞的生理特点1、细胞的分裂周期一般为1

3、248h，细胞分裂周期=间期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）G1期：凡细胞无增殖活动时皆滞留在G1期S 期：DNA的合成，一般为68小时G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色体螺旋化，持续时间短，一般为25h。M期：一般持续时间很短，仅0.51h。相当于有丝分裂的中后期和末期，主要是染色体的变化、分裂，并形成子细胞。二、动物细胞的生理特点2、细胞生长需贴附于基质，有接触抑制现象大多数正常二倍体（dipoid）细胞的生长都需要贴附在一定的基质，伸展后才能生长增殖。接触抑制或密度依赖抑制：当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，细胞与其周围细胞相互接触时，细胞停止增殖的现象。一旦细胞转化为

4、异倍体后，细胞可多层生长，细胞密度可大大增加。二、动物细胞的生理特点3、正常二倍体细胞的生长寿命是有限的原代培养：传代培养：有限细胞系：即有限的生长传代时间的细胞系，取决于细胞来源的种族和年龄，人胚成纤维细胞约可培养50代，鸡胚的30代，小鼠的8代。无限细胞系（连续细胞系）：当细胞突变为异倍体后，该细胞可无限继代二、动物细胞的生理特点4、动物细胞对周围环境比较敏感无细胞壁保护，因而外界的物理化学因素很容易产生影响。5、动物细胞培养基的要求高必需氨基酸需要12种以上维生素8种以上多种无机盐和微量元素主要碳原的葡萄糖多种细胞生长因子和贴附因子二、动物细胞的生理特点6、动物细胞蛋白的合成途径和修饰功

5、能与细菌不同游离的核糖体：合成蛋白质都在细胞质的基质内粗面内质网上的核糖体：合成的蛋白质是分泌性的和膜中的整合蛋白，多数为糖蛋白。糖链加工：蛋白质上的糖链有的在内质网上加接，有的在高尔基体中加接。其中内质网中加接的是N-链寡糖，在高尔基体内加接的是O-链寡糖。第三节 生产用动物细胞的要求和获得一、生产用动物细胞的要求原代正常组织分离的细胞二倍体细胞传代细胞按照FDA对细胞株的要求，控制最终产品中DNA残留量。二、生产动物细胞的获得原代细胞：是直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的。二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株

6、。转化细胞系：失去了正常细胞的特点，可以无限增殖。三、常用生产用动物细胞的特性（1）WI-38：女性高加索人正常胚肺组织的二倍体细胞系，核型2n=46。曾被广泛用于制备疫苗。（2）MRC-5： 1966年来源于14周正常男性，特性和用途与WI-38相似，对多种人的病毒敏感，用于疫苗的生产。三、常用生产用动物细胞的特性（3）CHO-K1：中国地鼠卵巢中分离的一株上皮样细胞。在培养时需加入脯氨酸。核型为2n=2022。CHO-dhfr-：一株缺乏二氢叶酸还原酶的营养缺陷突变株，培养时需次黄嘌呤和胸苷。三、常用生产用动物细胞的特性（4）BHK-21：来源：地鼠幼鼠的肾脏，经过单细胞克隆。特性：成纤维

7、细胞，2n=44。用途：（1）多用于增殖病毒，生产多瘤病毒、口蹄疫病毒和狂犬病毒疫苗（2）构建工程细胞。三、常用生产用动物细胞的特性（5）Vero：来源：正常的成年非洲绿猴肾；特性：贴壁依赖性成纤维细胞，2n=60，用途：支持多种病毒的增殖，用于脊髓灰质炎、狂犬病病毒疫苗生产。（6）Namalwa：来源：肯尼亚患有Burkitt淋巴瘤的病人，是一株人的类淋巴母细胞。特性：多数细胞有1214条标记染色体，单条X染色体，无Y染色体。用途：大规模生产-干扰素。三、常用生产用动物细胞的特性（7）SP2/0-Ag14：来源：从有抗羊红细胞活性的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合的

8、杂交瘤SP2/HL-Ag亚克隆中分离得到。特性：不分泌任何免疫球蛋白抗体链，能耐受8-氮鸟嘌呤（20g/ml），在含HAT选择培养基中不能存活。用途：用于单克隆抗体杂交瘤细胞的制备和抗体的生产和高表达宿主细胞三、常用生产用动物细胞的特性（8）Sf-9：来源：1977年从秋粘虫（Spodoptera frugiperda)的蛹卵组织，1983年从IPLB-SF21 AE中克隆形成。特性：它对苜宿尺蠖核型多角体病毒（Autographa california MNPV）和其他杆状病毒（Baculovirus）高度敏感。用途：广泛用于高效表达外来蛋白制品。四、基因工程细胞的构建和筛选真核细胞基因表达

9、载体的构建基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选1、真核细胞基因表达载体的构建（1）载体种类：病毒载体：牛痘病毒：广泛用于构建成多价疫苗，腺病毒：基因治疗载体逆转录病毒：基因治疗载体杆状病毒：成功地用于1000多种外源基因的高效表达。1、真核细胞基因表达载体的构建（2）质粒载体：要求：穿梭，即在细菌和哺乳动物细胞两者体内都能扩增。载体基本元件： 允许载体在细菌体内扩增的质粒序列，细菌体内复制的起始位点和抗生素标记基因。基因转录表达调控元件：启动子、增强子元件，3端应有终止序列、poly A序列等1、真核细胞基因表达载体的构建外源基因已整合的筛选标记两类标记：适合用于密切相关的突变细胞株，如采

10、用标记基因hgprt(次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 )、tk(胸腺嘧啶脱氧核苷激酶)和aprt(腺嘌呤磷酸核糖转移酶)等基因，它们仅适用于hgprt-、tk-和aprt-等基因缺失的细胞株。显性作用基因：如neo基因，它能使氨基糖苷抗生素新霉素磷酸化而失活。选择性增加拷贝数的扩增系统最常用的是编码二氢叶酸还原酶的基因（ dhfr ）。该酶的扩增可防止氨甲喋呤（MTX）对细胞的毒害作用。构建载体时将该基因与目的基因重组在一起，增加MTX浓度时，促使dhfr基因的扩增，同时也会使其毗邻的目的基因随之扩增，从而大大提高表达量。2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选（1）DNA导入动物细胞方法

11、 融合法 化学法 物理法 病毒法细胞融合法 DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法 重组逆转录病毒 脂质体介导法 DEAE-葡聚糖法 显微注射法 重组DNA病毒原生质融合法 染色体介导法 基因枪法 多瘤病毒样颗粒2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选（2）筛选：依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系统用HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择系统：筛选tk+、hgprt+的转化细胞；用GPT（HAT、黄嘌呤、甘氨酸、霉酚酸）选择系统：筛选gpt+(鸟嘌呤磷酸转移酶)的转化细胞；用G418（Geneticin）选择系统：筛选Neor的转化细胞；用MTX选择系统：筛选dhfr+的转化细胞。其次是

12、对选出的细胞进行克隆和亚克隆使其纯化最后利用其扩增系统，不断增加其基因拷贝数，从而获得高效表达而稳定的工程细胞株。五、细胞库的建立除原代细胞外，其它的细胞株、细胞系都需要建细胞库加以保存。按照我国和美国FDA的规定，用于生产的工程细胞必须建立两个细胞库：原始细胞库（master cell bank， MCB）生产用细胞库（manufactures working cell bank，MWCB）或称工作细胞库（working cell bank， WCB）。五、细胞库的建立1、MCB的细胞要求：(1)来源单一、均质。(2)具有该细胞详细档案细胞系的历史：来源、动物的年龄和性别、细胞分离的方法和所

13、用的培养材料等（若来源于人，则还需要知道该人的病史，以便检查是否存在着病原体）细胞的特性：形态、生长特性如倍增时间和分种比等。种源的特性，如核型、同工酶、细胞抗原以及特异的标记染色体等。若是用于生产的重组细胞，需有载体构建的资料、基因拷贝数、表达产物的性质和产量及其稳定性等。对各种有害因子的检查结果：细菌、真菌、支原体和各种病毒，包括逆转录病毒等。五、细胞库的建立3、MWCB的细胞：来源于MCB细胞，或从单一安瓿来，或从多个安瓿在融化即刻混合在一起的，然后经培养扩增到一定数量后，再分装储存形成的细胞库。建立档案：同样该细胞库也必须建立档案，而且需要进行无菌性和无细胞交叉污染的检查。生产时需确定

14、其最高使用的传代数。第四节 动物细胞的培养条件和培养基1、培养的基本条件： 绝对无菌操作；足够的营养供应，排除有害物质包括极其微量的离子掺入；适量氧气供应；随时清除细胞代谢中产生的有害产物；有良好的适于生存外界环境，包括pH、渗透压和离子浓度等；及时分种，保持合适的细胞密度。CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ，14 h)。箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。培 养 板、培养瓶第四节 动物细胞的培养条件和培养基一、动物

15、细胞的培养条件二、动物细胞培养基的种类和组成一、动物细胞的培养条件1、器材的清洗和消毒器材的清洗：需经浸泡、刷洗、泡酸和冲洗4个步骤，用过的器材最好尽快地浸泡在3%的磷酸三钠溶液内过夜，以除去蛋白质和残余细胞等污垢。器材的消毒灭菌：主要通过物理方法和化学方法来达到严格无菌的操作过程。一、动物细胞的培养条件2、水质处理方法：蒸馏、离子交换、电渗析、反渗透、中空纤维过滤等单独使用或配合使用，制备纯水。要求：金属离子含量很低，电阻值在18M以上。动物细胞制药用水，要求去热源。一、动物细胞的培养条件3、pH动物细胞培养的最适pH为7.27.4，低于6.8或高于7.6时会对细胞产生不利影响，严重时会引起

16、细胞退变甚至死亡。一般来说，传代细胞比原代细胞对pH变动的耐受性强，细胞量多时比细胞量少时耐受性强。细胞代谢也会造成pH变化，可用缓冲体系来稳定细胞周围环境的pH。一、动物细胞的培养条件4、渗透压在细胞培养的所有操作中，为了使与细胞接触的所有液体都保持有较合适的渗透压和pH，一般都需要使用平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS），它由无机盐和葡萄糖组成。二、动物细胞培养基的种类和组成1、培养基种类：天然培养基、合成培养基和无血清培养基。天然培养基：在细胞培养的早期阶段使用的培养基，主要为来自天然的材料如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。合成培养基：优

17、点是成分明确，组分稳定，可大量生产供应。动物细胞培养中常用的有BME、MEM、DMEM、HAM F12、RPMI 1640以及ISOCOV、199和McCoy等二、动物细胞培养基的种类和组成2、培养基的主要成份：氨基酸、维生素、糖类、无机盐以及一些特定成分如核酸的前体-腺苷、鸟苷等。3、血清：添加5%10%的小牛血清，杂交瘤细胞常用1020%的胎牛血清。血清的作用机制：（1）提供有利于细胞生长增殖所需要的各种生长因子和激素；（2）提供有利于细胞贴壁所需要的贴附因子和伸展因子；（3）提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白；（4）提供细胞生长所必须的脂肪酸和微量元素。二、动物细胞培养基的种类

18、和组成4、无血清培养基（1）优点：提高了细胞培养的可重复性，避免，避免了由于血清批之间差异的影响；减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；供应充足、稳定；细胞产品容易纯化；避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰和结果分析。（2）无血清培养基中的其它因子激素和生长因子：使用最多的是胰岛素，促进糖原和脂肪酸的合成，对细胞生长有刺激作用。结合蛋白：主要为铁传递蛋白和白蛋白。贴附和伸展因子：多数无血清培养基只适用于悬浮细胞，用以培养贴壁细胞的很少，也很贵，原因在于它们均缺少必需的贴附和伸展因子。其它有利于细胞生长的因子和元素：它们包括有消除氧自由基损

19、害的谷胱甘肽，某些微量元素，如硒等。细胞传代方法1悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液贴壁生长细胞传代方法1 吸光培养瓶中的培养液2 加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准），静置2-10 min（显微镜下动态监测）。3

20、吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5 吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。6 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。7 将后者放入培养箱中培养。细胞计数血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：人工计数培养细胞活力测定台盼蓝法：活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力。四唑盐（MTT）比色法：MTT商品名为噻唑蓝，(1)原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶

21、液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值(2)优点：MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。慢冻程序标准程序：

22、当温度在-25 以上时， 12 /min 当温度达-25 以下时， 510 /min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中 细胞冻存器简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存方法预先配

23、制冻存液：含20%血清培养基 10% DMSO 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。4 年后，存活率可达80。DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。对人造血干细胞的研究。细胞复苏方法（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。第五节 动物细胞培养的方法和操作方式一、动物细胞大规模培养的方法悬浮培养、贴壁培养和

24、贴壁-悬浮培养。二、动物细胞培养的操作方式其操作方式与细菌培养一样。分批式操作补料-分批（或流加式）操作半连续式操作连续式操作灌流式操作一、动物细胞大规模培养的方法1、悬浮培养细胞类型：非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。设备：通气搅拌式生物反应器和气升式生物反应器。2、贴壁培养细胞类型：贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。培养方式：灌流培养的方式固定化生物反应器一、动物细胞大规模培养的方法3、贴壁-悬浮培养，或称假悬浮培养（1）微载体培养：创造大的贴附面积，供细胞贴附生长增殖，载体体积小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥悬浮培养的一切优点。理

25、想的微载体具备的条件：生物相容性、无毒性、表面惰性、比重适当（1.0301.045g/ml）；粒径均一，在60250m之间（溶胀后）；光学透明、柔软耐高压灭菌温度、反复多次使用、制备简单、原料充分。一、动物细胞大规模培养的方法（2）包埋或微囊培养将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。载体材料：人工合成的polymer、糖类如纤维素等、蛋白质如胶原、纤维蛋白等。优点：可采用多种生物反应器进行大规模培养。（3）结团培养：利用细胞本身形成结团的特点，相互结团后再用悬浮的方法培养，操作简便，节省了用于微载体的成本。二、动物细胞培养的操作方式1、分批式操作（1）一种是将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培

26、养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累，最后将条件培养基（conditioned medium），即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。（2）先将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，向反应器内加入诱导剂或病毒等，经一端时间作用后，将反应物取出，如产生Namalwa干扰素和疫苗等。二、动物细胞培养的操作方式2、半连续式操作方式：当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。优点：操作简便，生产效率高，可长期进行生产，

27、反复收获产品，而且可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。二、动物细胞培养的操作方式3、灌流式操作方式：是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。与连续式操作的区别：取出部分条件培养基时，绝大部分细胞仍保留在反应器内，而连续式培养则同时也取出了部分细胞。优点：细胞处在较稳定的良好环境，有害代谢物浓度低；可极大地提高细胞密度，极大地提高了产品产量；产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利于产品质量的提高；生产成本明显降低。第六节 动物细胞生物反应器及其检测控制系统1、理想的动物生物反应器需具备基本要求：体系

28、中的材料无毒性；生物反应器结构的传质、传热和混合性能好；密封性能良好，避免外来微生物的污染；培养环境多种物化参数可自动检测和调节控制，控制的精确度高，且能保持环境质量的均一；可长期连续运转；容器加工制造时要求内面光滑，无死角；拆装、连接和清洁方便，耐高压蒸汽消毒便于操作消毒；设备成本尽可能低。第六节 动物细胞生物反应器及其检测控制系统一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构；二、动物细胞生物反应器的检测控制系统； 一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构1、搅拌罐式生物反应器借鉴细菌发酵罐得到的动物细胞反应器特点：（1）罐体的高径比一般采用11.5：1，利于增大与空气的接触面；培养动物的罐底为

29、圆形，以避免细胞和载体沉积在周边；（2）为防止搅拌产生的切力损伤细胞，搅拌速度慢，一般在20100r/min，故多数倾向于采用较大的倾斜式桨叶搅拌器或船舶推进式桨叶搅拌器；（3）一般采用无气泡通气系统，以解决由于气泡破裂时产生的应力对细胞的损伤；（4）高密度、长时间培养以及提高反应器的生产效率考虑，反应器常常需要配备有进出液体系统，以便进行灌流培养，并有使细胞与培养基分离使细胞保留在反应器内的装置。一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构2、气升式生物反应器与搅拌式生物反应器相比，具有剪切力小，混合均一，氧和营养的传递好，由于没有了机械搅拌的结构，有利于设备的密封，降低了造价。高径比一般在10：1左右。一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构3、中空纤维式生物反应器由数百乃至数千根中空纤维集束组成的反应器，纤维的材料为聚砜或丙烯共聚物，纤维壁厚为50100m，呈多孔性，内层为超滤膜，内腔直径为200 m，两端用环氧树脂等材料将纤维粘和在一起，并使内腔开口于外加的塑料圆筒，使形成两个隔开的腔。 ESC出口中空纤维细胞接种管培养基进口 中空纤维外部空间（ESC） 培养基出口一、动物细胞生物反应器的