抗菌材料的抗菌性能评价方法课件

1、第12章-抗菌材料的抗菌性能評價方法隨著現代科學技術的發展和人們對生活質量要求的提升，在利用有益微生物的同時應更加認識和警惕致病微生物的危害。自20 紀80年代以來，以日本、歐美為代表的工業發達國家在家用電 、電信通訊、化學建材、日用品、食品包裝等領域中開始使用抗菌防霉材料。隨著抗菌材料及其製品的研製開發，抗菌材料抗菌性能評價方法的探討也是多年來研究的重點。.但由這一新型材料發展時間較短，對其評價標準的研究仍處于初級階段。 國內外研究發現，對抗菌材料評價的研究主要是從材料抗細菌和抗真菌(主要是霉菌)作用效果方面著手，透過對抗菌劑、抗菌織物、抗菌塑膠、抗菌涂料、抗菌皮革、抗菌陶瓷等材料進行微生物

2、 (主要是細菌和真菌)試驗評價其殺死或抑制微生物的作用效果。 要客觀地評價抗菌材料，首先應了解微生物的影響。微生物在自然界中分佈很廣，是生態平衡不可缺少的一員。絕大部分微生物不會影響人類生活和健康，但部分微生物如致過敏菌和致病菌會影響人們健康，甚至威脅人們生命，還有部分微生物會危害動物和植物，破壞各種材料以及污染人們的生活環境。微生物的這些負面影響引起了社會和研究人員的廣泛關注，科學家們認識到研製開發抗菌 材料是保護人們生活健康及其環境的一項重要任務。 目前國內外涉及抗菌材料的相關檢測標準有30余篇，涉及化工、紡織、材料、電子，衛生等領域國際ISO/IEC標準，美國ASTM和AATCC兩大協會

3、標準，日本國家工業標準J1S ，英國國家標準BS、德國國家標準D1N以及我國的國家標準GB和行業標準等做了較為全面的調研和分析第1節-試驗條件要求 當進行微生物實驗時，由於試驗用微生物物都是潛在有害的，非常重要的注意事項是應保證實驗室中工作者的安全和避免環境的污染。為保證試驗的準確性和對結果的有效評價，以下兩點也非常重要一 對人員的要求操作者應符合生物操作規程對生物試驗人員的要求，並接受過相關微生物知識的培養訓練，具有實際操作的經驗。在操作時嚴格按照標準中的規範執行。 二對無菌條件的要求 為確保試驗用菌在保藏和試驗過程中無污染。而且試驗器材和受檢樣品不污染，試驗應在無菌狀態下操作:(1)實驗室

4、的空氣潔淨度應儘可能達到10000級，接種過程應在超淨台中進行，(2)對不同器皿和樣品應採用不同的滅菌或消毒方法處理(見表9-1)。 三、安全和預防措施 1.抗菌材料評價試驗使用的微生物主要是致過敏菌或致病菌，例如能使人感染和產生疾病。必須採用必要的和合理的預防措施，以免除對實驗室人員和周遭環境及有關人員的危害。當進行微生物操作時，應穿戴防護服、防護面具和手套，並應實施以下預防措施. 2.實驗室內應戴安全眼鏡; 3.所有的化學品應小心放置， 4.隨時準備眼藥水/護眼液，以備緊急使用戴.: 5.有污染的樣品和試驗材料應在處理之前滅菌，. 6.本操作中使用的暴露的化學品必須嚴格控制: 7.菌室內應

5、備有3%-5%來蘇水、70%乙醇溶液、0.5%新潔爾滅菌消毒劑。 第二節 試驗設備和器皿 一. 常用的儀器設備 抗菌性能檢測實驗室一般常用的儀器設備有恆溫恆濕培養箱 (37。C1。c)、冷藏箱(0-5。C)、超淨工作台(1000級)、生物光學顯微鏡、壓力蒸汽滅菌器、水浴振蕩器、離心機、電熱乾燥箱等。 二.常用的玻璃器皿和器具 一般常用的玻璃器皿和器具有:培養平皿、試管、移液管、離心管、接種環、酒精燈等。其中玻璃內因含有游離鹼，因此初次使用的玻璃器皿應浸于2%鹽酸俗掖內除去游離鹼，浸泡數小時後用自來水洗乾淨，滅菌後使用。 第三節試驗用試劑和菌種一.培養基 培養基 培養基用于人工培養微生物，為微生

6、物生長繁殖提供必要而充分的營養物質如水分、碳源、氮源、無機鹽和生長因子。以下介紹 常見的培養基。 1.培養細菌常用培養基 (1)營養瓊酯(NA)，成分；蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂15-20g製備: 取上述成分，加入1000 mL蒸餾水中，加熱融化，用 0.1mol/L NaOH溶液調節pH值，使滅菌後為7.O-7.2，分裝後置壓力蒸汽滅菌器內，于121。C滅菌30min。 (2)伊芳紅美藍瓊脂(EMB) 成分:蛋白胨20g，牛肉膏5g，蔗糖10g，葡萄糖1g,:氯化鈉5g，硫酸亞鐵氨Fe(NH4)2(S04)2.6H200.2g，硫代硫酸鈉0.2g，瓊脂12g-, 酚紅0.02

7、5g。 製備: 同營養瓊脂 (3)SCDLP肉湯瓊脂培養基 成分；酪素胨17.0g，大豆蛋白胨3.0 g，氯化鈉5.0 g，磷酸一氫鉀2.5g，葡萄糖2.5g，卵磷脂 1.0g， 瓊脂15.0g。 製備: 溶解後用NaoH溶液 調PH為6.8-7.2.，于115oc滅菌 20 min. 2. 培養真菌常用培養基 (1)馬鈴薯一葡萄糖瓊脂(PDA) 馬鈴薯用水洗淨，去皮切小塊。稱取200g，加1000mL蒸餾水，加熱煮沸1h。 然後用雙層紗布擠出濾液，將濾液加蒸餾水1000mL，加入葡萄糖20g。瓊脂20g，加熱熔化，用0.1-mol/L NaOH溶液調節pH值，使滅菌為6.0-6.5，于115

8、oc滅菌30min。 (2)營養鹽瓊脂 成分；硝酸鈉2.0g，磷酸二氫鉀，0.7g，磷酸氫二鉀0.3g，氯化鉀0.5g，硫酸鎂(MgS04-7H20) 0.01g, 硫酸亞鐵(FeSOo.7H20) 0.01g，蔗糖30g， 瓊脂15-20g。 製備: 取上述成分，加人1000-L蒸餾水中，加熱融化，用 0.1ml/L NaOH溶液調節pH值，使滅菌後為6.0-6.5分，後置壓力蒸汽滅菌器內，于115oC滅菌30min. (3)麥芽汁培養基 可直接購買，使用前分裝，置壓力蒸汽滅菌器內，于115。C滅菌30min (二) 培養液和洗脫液 培養液通常用于接種和培養微生物，洗脫液是抗菌試驗和微生物試

9、驗中從樣品中洗脫微生物所用溶液。 營養肉湯培養液(NB) 成分是營養瓊脂(NA)不加 瓊脂的成分，製備方法也相同。 營養鹽培養液成分是營養鹽瓊脂不加瓊脂的成分，加入 0.05%潤濕劑配製。 (3) 磷酸緩衝液(PBS)；成分是磷酸氫二鈉2.83g、磷酸二氫鉀1.36g、蒸餾水1000mL，使用濃度為.0.03-mol/L。 (二)中和劑 進行微生物試驗時，樣品取出時即完成微生物接觸培養後，殺菌過程應隨之停止，用于中和抗菌作用的物質稱為中和劑表9-2 列舉了部分傳統抗菌劑常用的中和劑。 (三)分散/濕潤劑 指可分散、懸浮微生物，且保持水分作用的無毒表面活性劑類物質。在抗菌檢測中常用的有吐溫80或

10、吐溫60、N-甲基乙磺釀、二辛基丁二磺酸鈉、聚乙二醇、月桂酸鈉。 (四)試驗用菌 ( 一)常用細菌 據統計，人体常見感染部位主要病原体是大腸杆菌、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌、肺炎克雷伯菌、腸球菌、白色念珠菌等。織物上常分離的細菌是肺炎克雷伯菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、綠膿假單胞菌對金 色葡萄球菌、銅綠棘毛杆菌等。塑膠上常分離的細菌是綠膿假單胞菌、金黃色葡萄球菌等。涂料上常分離的細菌是藤八疊球菌、海生黃杆菌、銅綠棘毛杆菌等。因此這些細菌的標準菌株也常用做抗菌材料檢測用的試驗用菌。:, （二）常用真菌. 研究表明，織物上常分離出的真菌是綠色木霉、土曲霉、黃曲霉、黑曲霉、煙曲霉、球毛殼，繩狀青

11、霉、褚色青霉、宛氏擬青霉等。塑膠上常分離.出的真菌是黑曲霉、土曲霉、雜色曲霉、橘青霉、常見青霉、宛氏擬青霉、球毛殼、綠色木霉、出芽短梗霉、青霉等。涂料上常分離出的真菌是薩氏曲霉、曲霉、黑曲霉、白曲霉、構巢曲霉、紫色青霉、宛氏擬青霉、木霉等。皮革上常分出的真菌是枝頂孢霉、白曲霉、黃曲霉、煙曲霉、芽枝霉、橘青霉、常見青霉對短柄帚霉等。因此在抗菌檢測中這些真菌的有關菌常用做試驗用菌。霉菌的試驗用菌也常根據抗菌製品的具體使用場合由具體用戶指定。. 第四節 試驗方法及評價標準 目前國內外研製開發的抗菌材料種類很多，對這些材料的微生物性能主要是通過做生物實驗對材料抗菌性能進行定性和定量的評價，並需要根據材

12、料的具體使用環境進行毒理實驗，評價材料的安全性。本節主要介紹抗菌劑對抗菌織物對抗塑膠、抗菌涂料和抗陶瓷的抗菌性評價方法及標準。 一、抗菌劑的抗菌性測定 抗菌劑通常是具有一定程度的抑制或殺死細菌或真菌作用的藥物，其作用倚賴于使用的濃度。因此對抗菌劑的研究通常根據抗菌劑的效果即抑菌和殺菌作用進行抗細菌和抗真菌的評價。 （一）抑菌作用的評價 抑菌作用是抗菌劑抑制生長的微生物群體的正常繁殖，如抑菌作用超過一定時間，最終就會導致死亡。所以在抑菌試驗中需要控制培養時間和溫度。一種對抗菌劑敏感的微生物，在延長培養時間後，抗菌劑會表現出對該微生物的殺菌作用。抑菌作用的評價通常採用定性的方法，即連續稀釋法和培養

13、基擴散法。在試驗中均應根據抗菌劑的組分選用適當的溶劑稀釋，如溶于水的抗菌劑可直接用蒸餾水或生理鹽水稀釋(需與鹽不反應)，不溶于水的特別是有機抗菌劑可選用惰性有機溶劑如丙酮和乙醇，但須做溶劑對照試驗。如無法形成溶液，能得到一個彌散很好的懸浮液或乳濁液即可。 1.連續稀釋法 一般進行幾何系列稀釋，用恆定比例(通常是2倍)，將液體從一試管轉移到另一試管的稀釋方法。由於誤差是累積的，稀釋小於 4倍無意義。該方法可定量測定抗菌劑的最低抑菌濃度(MIC), 可在液體培養基或固體培養基中進行，通常用mg/L表示。 其中試管液體培養基稀釋法最為常用。具體操作是；細菌檢測培養基通常採用營養肉湯培養，將約為104

14、-105個/mL濃度的接種菌液分裝13個試管中，第一只試管中加入一定量的抗菌劑，並做2倍連續稀釋至第12只試管，第13只試管作為生長對照，放置在37。C培養16 24hr，觀察結果，無菌增殖的最高稀釋管的、抗菌濃度，為最低抑菌濃度(MIC)。對于真菌檢測也可用同樣方法，但應採用PDA培養基且培養溫度為28。C。由于該方法受培養溫度對pH值等因素的影響，因此在試驗前必須選擇適宜的條件，另外接种量即菌液濃度和培養時間的不同直接影響MiC值。如抗菌劑對同一菌株，接種量小時為敏感即M1C值也小。試驗觀察一般要在12-18 時進行，如時間過長，輕度抑制的細菌可能會開始繁殖，另一 方面一些抗菌劑因時間過長

15、作用減弱，受抑制的細菌會再次繁殖。 2.培養基擴散法 本法是將抗菌劑置於巳接種待測菌的固體培養基上，抗菌劑通過，向培養基內的擴散抑制菌的生長，出現抑菌環。由於抗菌劑擴散 的距離越遠達到該距離的抗菌劑濃度越低，故可根據抑菌環的大小判斷細菌對抗菌劑的敏感度。該方法適用於溶出型抗菌劑，對于在培養基中擴散能力差的抗菌劑不適用。 具体操作是:選用定性濾紙製成直徑約6-mm的小圓片，將接種一定濃度菌的培養基傾注平板並凝固，將濾紙圓片置於平板培養基上，稀釋不同濃度的抗菌劑溶液以每片濾紙吸水量為0.01mL滴加在濾紙上，放置30min後，在一 定溫度下培養16-24h，觀察並測量抑菌環的大小。通常會發現抗菌劑

16、的濃度對數值與抑菌環的直徑成正比(在實驗誤差範圍內)。 對于細菌和真菌的檢測可用此方法，只是培養基和培養時間有所不同。 ( 二 )殺菌作用的評價 殺菌作用是由於微生物和抗菌劑接觸後產生了一些不可逆的致死過程，如脢失活、膜破壞或氧化。殺細菌/真菌試驗是使大量微生物與抗菌劑接觸，培養不同時間後測定活菌數，是一種定量方法。在該試驗中經活菌計數無菌落生長並不意味著無菌，未發現活菌可能是因菌落體積太小而影響觀察結果。大量重複試驗發現結果相當差異，取平均值才有意義。殺菌作用評價試驗的終點定為全部殺死或無菌並不科學，大多數研究者認為殺死細菌百分數為99.9%定義為殺菌作用的終點更為合理。殺細菌試驗具體方法是

17、用活菌計數來評價，在一定量細菌接觸抗菌劑後(通常是10-min)數活菌數，用殺死細菌的百分數表示。 為避免熱瓊脂對菌的傷害帶來的影響，Mi1es和Misra設計了表面計數法，用移液管將少量不同稀釋度的菌液(通常是0.1-0.2 mL)均勻涂布在凝固的瓊脂平板培養基表面，培養後，選擇合適的稀釋度進行活菌計數。應當注意在試驗中取菌培養進行活菌計數時，殺菌作用必須在這之前停 。因此需要選擇合適的中和劑或稀釋沖淡。如鹵素可採用硫代硫酸鈉，苯甲酸可加蒸餾水稀釋。另外稀釋液的選擇也很重要，一般認為用蒸餾水.、生理鹽水對細菌細胞均有破壞作用， 可選用0.1%蛋白胨溶液。殺真菌試驗與殺細菌試驗相同，也可用定量

18、法測定抗菌劑的殺真菌作用。 二、抗菌材料及其製品抗菌性能的評價 抗菌材料通常是在一些材料中加入少量抗菌成分(如抗菌劑), 使材料及其製品在保持原有使用功能和安全性的同時賦予其抑制微生物侵蝕和衛生自潔的功能。. (一)抗細菌性能評價方法 1.平板培養基法 平板培養基法是測定材料抗菌性能的一種定性方法。該法將樣品放在接種的平板培養基上，樣品與被測菌充分摸觸培養(18- 24h)或一段時間(2-4星期)後觀察抑菌效果。此方法是典型的定性方法，適用評價織物、塑膠、涂料、陶瓷、皮革等的抑菌作用，是在測定抗菌劑抑菌環的擴散法基礎上改進而來的。該方法同樣有一定局限性，即只適用于含有溶出型抗菌劑的抗菌材料及其

19、製品的測定。 在查到的國內外標準中，美國材料與試驗協會標準ASTM G22塑膠耐細菌的測定.操作A、美國染化工業者協會標準AATCC 90-1982 纖維抗細菌性測定方法 -平板培養基法、 英國國家標準部6085-1992織物對微生物腐蝕的抑制性的測定. 部分4.接觸細菌培養基平板試驗、日本國家工業示準J1S L 1902纖維製品的抗細菌性的試驗方法.部分7標準中均採用 此方法。 2.平板劃線法 20世紀90年代以來對平板培養基法進行了改進，採用劃線法 (streak-ethod)，即在平板培養基上平行劃線接種後接觸樣品進行評價的方法。這種方法是觀察樣品與接種區域和非接種區域接觸的不同現象，更

20、能客觀地了解抗菌產品的抑菌作用及抗菌處理的效果。該方法適用評價的材料範圍與平板培養基法一樣廣泛，但仍只適用于含有溶出型抗菌劑的抗菌材料及其製品的測定，材質不限。 板劃線法也是一種定性的方法。 3.奎.因法(定性法) 奎因法(Quinn test)也是抗菌材料抗菌性能測定的一種定性方法。該方法是將樣品包埋于一定量菌液的培養基內，在一定條件下培養一定時間後觀察細菌在樣品上及周遭的生長情況和測定樣品受侵蝕情況。該方法也是國際上常用的微生物試驗方法。該方法在 料對織物等材料微生物評價試驗中經常用到，適于評價抗菌塑 料對抗菌織物等的抗菌效果。 浸漬法 浸漬法是抗菌材料抗菌性能檢測的一種定量的方法。把一定

21、量的菌液均勻滴入樣品中，樣品與菌接觸培養一定時間後計算菌數減少率，即抗菌率。該方法是一種定量的方法。美國科學家在這種方法的研究中提出，該方法需要在定性實驗的前提下進行，如測得樣品可能有殺菌作用，才繼續用此方法計算抗(殺) 菌率。作者在研究中也發現，只有在樣品抗菌性較強時，定量評價才有意義。該方法適用于吸水性材料及其製品如織物、泡沫塑料等的評價。 5.貼膜法 貼膜法是目前最常用的抗菌性能檢測方法之一，是一種能定量描述材料抗菌性能的檢測方法。將菌液滴加在樣品上，鋪蓋薄膜使菌液均勻涂覆在樣品表面，接觸一定時間(6-24h)後。計算樣品的抗細菌率。也叫薄膜密著法。適用于塑膠(不包括發泡製品)、陶瓷、涂

22、料等非吸水性材料及其製品的評價。I 6.振蕩法 振蕩法(shake flask test)也是一種定量檢測抗菌材料的抗菌性能的方法。此方法是把樣品浸泡在一定濃度的菌液中不斷振蕩培養，一定時間後樣品洗脫，活菌計數並計算抗菌率。該方法適用于織物，發泡塑料，對一次性衛生用品或面積較小的製品的測定，可加速反應，在較短時間內檢測出結果。美國道康寧公司企業標準就是用此方法對織物類抗菌材料進行測定的。 (二) 抗真(霉)菌性能評價方法 從微生物學角度來說，細菌是以群體數日的增長作為生長標誌的，而霉菌是以菌絲的體積或質量的增長來衡量生長情況的，因此抗霉菌性能通常以霉菌生長面積為標準，即定性測定長霉等級的方法。

23、 平板培養法 將樣品置於培養基上，在樣品及培養基表面均勻地加人一定量的混合孢子懸液(可用噴霧器或微量移液管)，培養一定時間(通常為4星期)，定期觀察，按霉菌生長情況(覆蓋面積)分等級評價， 抗菌樣品的抗霉菌性能。該方法可透過直觀分析霉菌在材料上的生長情況及抗菌材料對霉菌的抑制情況，另外透過試驗儀器測定材料在培養前後力學性能、光學性能等的變化。 2.懸掛曝露法 此方法是把樣品曝露于霉菌生長的場所，來測定樣品長霉的程度。這種方法為試驗提供更大的空間模仿自然環境。但操作上較不方便，容易污染環境。 AATCC30-1993試驗4.保濕培養瓶測定(混合孢子懸液)、BS6085-l992部分4.保濕環境下

24、的試驗等標準均采用此方法。 3.3.土壤填埋法 此方法是將樣品埋于土壤中，在一定的濕度、溫度下培養，土壤中微生物(主要為真菌)直接作用于樣品，一定時間(通常為4星期)後觀察長霉程度及性能變化。 AATCC30-1993試驗1.土壤填埋法，AATCC174- 1993抗真菌行為的評價抑制地毯的霉變、BS6085-1992 部分2.土壤填埋試驗、D1N539333-1(同EN IS011721-1)等均採用此方法。 (三)抗菌性能評價匯總 將抗菌材料抗菌性能評價的相關標準進行了匯總和分析，詳見 附錄。 (四) 抗菌長效性評價 對于抗菌塑膠抗菌性的穩定性即長效性，國內外有研究報道，但標準尚不成熟。我

25、國國家標準GB l5979-1995附示B中的B3 穩定性試驗條件設計了測定產品抗菌長效性的加速試驗:將樣品置 54-57。C水浴中14天或37-40。C水浴中3個月，進行抑菌或殺菌性能測試。 根據測出的幾個時間點的有效成分溶出量，用外推法推出整個使用過程中的有效成分溶出傾向(見圖9-1)。從曲線可以看出有效成分溶出量達到一定值後其溶出繼續緩慢進竹，根據實測溶出曲線外推，.使用20年後其有效成分溶出量遠遠低於總含量，樣品能長期保持抗菌作用。用以上方法對樣品浸泡一定時間後測定抗菌率，結果見表9-3。 對抗菌塑膠能否長期保持抗菌作用的研究仍處于初級階段，試驗方法尚不成熟，需要今後對產品長效性的試驗

26、方法及其評價進一步研究。 第五節 相關標準實例 第四節中介紹的系列方法僅具有普遍性，但不同的材料由於自身的特點，同一種方法具體操作也有所不同。以下詳細介紹不同抗菌材料的抗菌性能試驗方法的國內外有關標準。 抗菌織物織物特別是棉毛類織物很容易受微生物的侵蝕，因此國外很早就開始了對織物抗菌的研究，其中美國、英國、德國、日本等發達國家都先後推出了對織物抗細菌和真菌的系列標準。據報道近年將推出抗菌織物的ISO國際標準，可見抗菌織物的研究走到了抗菌材料評價的前沿。目前已經實施的相關標準如下。 WSPLIEBxuqnjgc952-*!YURNKGDAwtpmifb841)&#XTQMJFCyvrokhda6

27、30(%ZWSPLIEBxuqnjgc952-*!YURNKGDAwtpmifb841)&#XTQMJFCyvrokhda630(%ZWSPLIEBxuqnjgc952-*!YURNKGDAwtpmifb841)&#XTQMJFCyvrokhda630(%ZDAwtpmifb851-&!XUQNJGCzvsolhea730(%ZWSPLIFByurnkgd962+*$YVROKHDAwtpmifb851-&!XUQNJGCzvsolhea730(%ZWSPLIFByurnkgd962+*$YVROKHDAwtpmifb851-&!XUQNJGCzvsolhea730(%ZWSPLIFByurn

28、kgd962+*$YVROKHDAwtpmifb851-&!XUQNJGCzvIEBxuqnkgd962+*$YVROKHDAwtpmifb841)&#XUQNJGCzvsolhea730(%ZWSPLIEBxuqnjgd962+*$YVROKHDAwtpmifb841)&#XTQNJGCzvsolhea730(%ZWSPLIEBxuqnjgd962+*$YVROKHDAwtpmifb841)&#XTQNJGCzvsolhea730(%ZWSPLIEBxuqnjgd962+*$YCzvsolieb740)%#WTPMIFByurnkgd962+*$YVSOLHEAxtqmjfc851-&!XU

29、QNJGCzvsolieb740)%#WTPMIFByurnkgd962+*$YVSOLHEAxtqmjfc851-&!XUQNJGCzvsolieb740)%#WTPMIFByurnkgd962+*$YVSOLHEAxtqmjfc851-&!XUQNJGCzvsolieb740d962+*$YVROKHDAxtqmjfc851-&!XUQNJGCzvsolhea730)%#WTPMIFByurnkgd962+*$YVROKHDAxtqmjfc851-&!XUQNJGCzvsolhea730)%#WTPMIFByurnkgd962+*$YVROKHDAxtqmjfc851-&!XUQNJGCz

30、vsolhea730)%#WTPMIFByurnkgd96URNKGDzwsplieb740)%#WTPMIFCyvrokhda63+($ZVSOLHEAxtqmjfc852-*!YURNKGDzwsplieb740)%#WTPMIFCyvrokhda63+($ZVSOLHEAxtqmjfc852-*!YU*!YURNKGDzwsplieb741)&#XTQMJFCyvrokhda63+($ZVSOLHEBxuqnjgc952-*!YURNKGDzwsplieb741)&#XTQMJFCOLHEAxtqmjgc952-*!YURNKGDzwsplieb740)%#WTQMJFCyvrokhda

31、63+($ZVSOLHEAxtqmjgc952-*!YURNKGDzwsplieb740)%#WTQMJFCyvrokhda63+($ZVSOLHEAxtqmjfc952-*!YURvrokhea730(%ZWSPLIEBxuqnjgc952-*!YUROKHDAwtpmifb841)&#XTQMJFCyvrokhea730(%ZWSPLIEBxuqnjgc952-*!YUROKHDAwtpmifb841)&#XTQMJFCyvrokhea730(%ZWSPLIEBxuqnjgc952-*!YUROKHDAwtpmifb84hda63+(%ZWSPLIEBxuqnjgc952-*!YURNKG

32、Dzwtpmifb841)&#XTQMJFCyvrokhda63+(%ZWSPLIEBxuqnjgc952-*!YURNKGDzwtpmifb841)&#XTQMJFCyvrokhda63+(%ZWSPLIEBxuqnjgc952-*!YURNKGDzwtpmifb841PLIEByurnkgd962+*$YVROKHDAwtpmifb841-&!XUQNJGCzvsolhea730(%ZWSPLIEByurnkgd96gd962+*$YVROKHDAxtqmjfc851-&!XUQNJGCzvsolhea730)%#WTPMIFByurnkgd962+*$YVROKHDAxtqCzvsolh

33、ea730(%ZWSPMIFByurnkgd962+*$YVROKHDAwtpmifc851-&!XUQNJGCzvsolhea730(%ZWSPMIFByurnkgd962+*$YVROKHDAwtpmifc851-&!XUQNJGCzvsolhea730(%ZWSPMIFByurnkgd962+*$YVROKHDAwb740)%#WTPMIFByurnkhda63+($ZVSOLHEAxtqmjfc851-&!XURNKGDzwsplieb740)%#WTPMIFByurnkhda63+($ZVSOLHEAxtqmjfc851-&!XURNKGDzwsplieb740)%#WTPMIFBy

34、urnkhda63+($ZVSOLHUQNJGCzvsplieb740)%#WTPMIFByurnkgd962+*$ZVSOLHEAxtqmjfc851-&!XUQNJGCzvsplieb3+(%ZWSPLIEBxuqnjgc952-*!YURNKGDzwtpmifb841)&#XTQMJFCyvrokhda63+(%ZWSPLIEBxuqnjgc952-*!YURNKGDzwtpmifb841)&#XTQMJFCyvIEBxuqnjgc952-*!YURNKGDzwsplieb841)&#XTQMJFCyvrokhda63+($ZVSOLIEBxuqnjgc952-*!YURNKGDzwsp

35、lieb841)&#XTQMJFCyvrokhda63+($ZVSOLIEBxuqnjgc952-*!YURNKGDzwspl0(%ZWSPLIEBxuqnjgd962+*$YVROKHDAwtpmifb841)&#XTQNJGCzvsolhea730(%ZWSPLIEBxuqnjgd962+*$YVROKHDAwtpmifb841)&#XTQNJGCzvsolhea730(%ZWSPLWSPMIFByurnkgd962+*$YVROKHDAwtpmifc851-&!XUQNJGCzvsolhea730(%ZWSPMIFByKHDAwtpmifb841)&!XUQNJGCzvsolhea730

36、(%ZWSPLIEBxurnkgd962+*$YVROKHDAwtpmifb841)&!XUQNJGCzvsolhea730(%ZWSPLIEBxuqnkgd962+*$YVROKHDAwtpmifb#WTPMIFByurnkgd962+*$ZVSOLHEAxtqmjfc851-&!XUQNJGCzvsplieb740)%#2+*$YVROKHEAxtqmjfc851-&!XUQNJGCzvsolhea740)%#WTPMIFByurnkgd962+*$YVROKHEAxtqmjfc85RNKGDzwtpmifb841)&#XTQMJFCOLIEBxuqnjgc952-*!YURNKGDzws

37、plieb841)&#XTQMJFCyvrokhda63+($ZVSOLIEBxuqnjgc952-*!YURNKGDzwsplieb841)&#XTQMJFCyvrokhda63+($ZVSOLIEBxuqnjgc952-*740)%#XTQMJFCyvrokhda63+($ZVSOLHEAxtqnjgc952-*!YURNKGDzwsplieb740)%#XTQMJFCyvrokhda63+($ZVSOLHEAxtqnjgc#XTQMJFCyvsolhea730(%ZWSPLIEBxuqnjgc952-*$YSPMIFByKHDAwtpmifb841)&!XUQNJGCzvsolhea73

38、0(%ZWSPLIEBxurnkgd962+*$YVROKHDAwtpmifb841)&!XUQNJGCzvsolhea730(%ZWSPLIEBfc851-&!XUQNJGCzwsplieb740)%#WTPMIFByurnkgd962+*$ZVSOLHEAxtqmjfc851-&!XUQNJGCzvsplieb740)%#WTPMIFByurnkgd962+*$ZVSOLHEAxtqmjfc851-&!XUQNJGTPMIFByurnkgd962+*$YVROKHEAxtqmjfc851-$ZVSOLHEAxJGDzwsplieb740)%#WTPMIFByurnkgd963+($ZVSOLHEAxtqmjfc851-&!XUQNJGDzwsplieb740)%#WTPMIFByurnkgd963+($ZVSOLHEAxtq