《动物传染病学（实验）》课件5 临床血清学快速检测技术

1、实验四、临床血清学快速检测技术当前，新发动物疫病不断发生，老病出现新症状，多重复合感染，动物疫病日趋复杂。研制快速、准确、廉价的诊断试剂是动物疫病防制的迫切需求。在动物传染病的预防与控制中，疾病的诊断，病原学与流行病学调查与研究非常重要，但这都需要简便快速、敏感特异的诊断方法与试剂盒。新型诊断试剂的研究快速检测方法抗原检测方法抗体检测方法乳胶凝集试验（LAT)胶体金试纸条酶联免疫吸附试验(ELISA)乳胶凝集试验（LAT)胶体金试纸条酶联免疫吸附试验(ELISA)常规诊断LAT鉴别诊断LAT常规诊断ELISA鉴别诊断ELISA聚合酶链反应（PCR）一、胶体金试纸条诊断试剂（一）简 介 胶体金试

2、纸条诊断是采用胶体金免疫层析技术研制而成，该技术是90年代初在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，最先用于人绒毛膜促性腺激素（HCG）的测定和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）等检测。胶体金（Colloidal gold）是氯金酸（HAuCl4）的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。质量好的胶体金：溶液呈红色，胶体金颗粒为球形，大小均一，无棱角。质量差的胶体金：溶液呈紫色，大小不一，形状各异。胶体金的质量判定标准胶体金标记技术（Immunogold labeling technique）是以胶体金作为示踪标记物应用于

3、抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。胶体金标记的原理：胶体金在碱性条件下带负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电吸引而形成牢固结合。（二）胶体金试纸条诊断技术的原理 以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色（红色）反应，检测抗原/抗体。最常用的是双抗夹心法检测抗原试验所用试剂全部为干试剂，主要有： 1. 免疫金复合物干片2. 特异抗体3. 抗小鼠IgG胶体金标记的单克隆抗体（小鼠IgG）多个试剂被组合在一个约6mm70mm的塑料板条上，成为一单一试剂条：A和B：硝酸纤维素膜条的上端和下端C：免疫金复合物干片，

4、紧贴硝酸纤维素膜条T：包被特异抗体的测试区R：包被抗小鼠IgG的参照区 1.测定时将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经C处时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。测 定2.若标本中有待测特异抗原，其时可与免疫金复合物之抗体结合，此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条（T）。测 定测 定3.过剩的免疫金复合物继续前行，至参照区与固相抗小鼠IgG结合（免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠IgG），而显出红色质控线条（R）。测 定4.反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。样品垫连接垫层析模检测线对照线吸水垫背衬胶体金试纸条构成示

5、意图检测线质检线金标颗粒吸收垫样品垫硝酸纤维素膜胶体金试纸条示意图胶体金快速诊断技术的特点 1.简捷快速：操作简单，一般只要5-10min 就会出结果，而其它方法如ELISA需要1-2h， PCR 需要时间更长。2.结果易于判定：阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易判断。3.特异性好：因为该技术大多用于单克隆抗体标记，这决定了它具有很好的特异性。1.病毒性疾病：传染性法氏囊病、禽流感、新城疫、犬细小病毒、猪瘟等。2.寄生虫疾病：血吸虫病、旋毛虫病、囊虫病、恙虫病。3.细菌性疾病：霍乱弧菌、类鼻疽。胶体金快速诊断技术的应用（三）实验材料1.流感胶体金试纸条试剂盒2.枪头3.被检样品4.移液器（四）操作

6、方法1.用移液器吸取被检样品20l，滴在试纸条的加样孔中。2.静置510分钟。3.观察反应结果。阳性结果阴性对照（五）结果判定二、乳胶凝集试验 Latex agglutination test， LAT一、实验目的二、实验原理三、实验材料四、操作步骤五、实验注意事项六、实验结果处理乳胶凝集试验（一）实验目的1.了解并掌握乳胶凝集试验的基本原理。2.掌握乳胶凝集试验检测细小病毒抗体快速检测方法的操作方法和结果判定方法。（二）基本原理 乳胶凝集试验是以聚苯乙烯乳胶颗粒作为载体，吸附特定的抗原或抗体，当遇到血清中相应的抗体或处理过的病料中相应的抗原成份时，会形成肉眼可见的凝集颗粒。1.普通乳胶：依靠

7、物理吸附发生致敏。2.羧化乳胶：通过化学发应在乳胶颗粒和致敏原之间形成酰氨键，发生化学偶联致敏乳胶，从而更稳定。3.双色乳胶：缓冲液和乳胶颗粒为不同的颜色，结果更易于观察。乳胶类型（三）实验材料1.洁净玻片2.枪头3.细小病毒致敏乳胶4.细小病毒病阳性、阴性或临床待检血清（四）操作方法1.在一洁净的玻片的不同位置滴加3滴致敏乳胶（每滴约20l）。2.用移液器分别取20l的待检血清，滴加到上述3滴致敏乳胶中，并用枪头混匀。3.轻轻摇晃玻片，使抗原和血清充分混匀，静置1-2分钟，观察结果。（五）实验注意事项1.取不同试剂时应注意更换枪头，防止交叉污染。2.混匀过程中，避免阳性对照、阴性对照和被检样品之间的交叉污染。乳胶凝集的阴性和阳性反应（六）结果判定判 定 标 准 + 为全部乳胶凝集，颗粒聚集于液滴边缘，液体透明； + 为大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊； + 为50乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊； + 有极少量的凝集，液体呈混浊； - 呈原有的均匀乳状。 致敏乳胶试剂与被检血清样品检测结果致敏乳胶试剂 + + + - + - + + +空白乳胶试剂乳胶凝集试验的特点1.操作简捷，结果易于判定；2.敏感性较低；3.致敏乳胶的稳定性低，保存期短。乳胶凝集试验的应用1.病毒性疾病：伪狂犬