阿霉素联合雌二醇诱导慢性肾脏病肾阳虚证大鼠模型的建立与

1、阿霉素联合雌二醇诱导慢性肾脏病肾阳虚证大鼠模型的建立与评价及真武汤干预作用研究收稿日期：2021-07-02修回日期：2021-10-22国家科技部重点研发计划资助项目（2018YFC1704300）：“肾阳虚证”辨证标准的系统研究，负责人：王拥军；国家科技部重点研发计划资助项目课题（2018YFC1704304）：慢性肾脏病“肾阳虚证”辨证标准的系统研究，负责人：赵宗江。通讯作者：赵宗江，教授，博士生导师，博士后合作导师，主要研究方向：中医药防治慢性肾脏疾病分子机制研究。*张萌萌，基金项目 * 国家科技部重点研发计划资助项目 (2018YFC1704300)：“肾阳虚证”辨证标准的系统研究，

2、负责人：王拥军；国家科技部重点研发计划资助项目课题（2018YFC1704304）：慢性肾脏病“肾阳虚证”辨证标准的系统研究，负责人：赵宗江。第一作者 张萌萌，在读硕士，从事中医药防治慢性肾脏疾病分子机制研究，E-mail： HYPERLINK mailto:1023404572 1663951088通信作者*赵宗江，教授, 博士生导师, 博士后合作导师，从事中医药防治慢性肾脏疾病分子机制研究，TelE-mail：zongjiangz 张新雪，郑鹏飞，吴英杰，吴琪，杨涛，赵宗江*（北京中医药大学中医学院 北京 102488）摘要：目的： 探索慢性肾脏病肾阳虚证动物模

3、型的建立与评价标准及真武汤干预作用的研究。方法： 49只雄性SD大鼠，进行适应性喂养，为期2周。随机分为正常组10只和模型组39只。模型组大鼠分别于第3周、第4周尾静脉注射阿霉素3 mg/kg-1、4 mgkg-1/kg，建立慢性肾脏病动物模型。将成模大鼠随机分为阿霉素组13只、雌二醇组13只、真武汤组13只，第13周起，雌二醇组、真武汤组腹腔注射雌二醇玉米油稀释液（4 mgkg-1/kg）构建慢性肾脏病肾阳虚证病证结合动物模型，真武汤组同时按照5.39gkg-1d-1进行灌胃给药。观察大鼠一般情况；每周称取大鼠体质量，每4周检测大鼠24h尿蛋白定量；使用红外测温枪检测大鼠体温变化，采用游泳耐

4、力实验检测大鼠游泳时间；第24周，股动脉取血并处死大鼠，将大鼠肾脏、脾脏、睾丸称重并计算脏器指数；采用HE和Masson染色观察大鼠肾组织的病理变化情况；分离血清后用比色法检测Scr、UA、BUN、TP、ALB、TC、TG，用酶联免疫法检测CORT、FSH、LH、T、E2、T3、T4、TSH、SOD。结果： 与正常组比较，雌二醇组大鼠出现毛发无光泽、弓背蜷缩、消瘦、活动减少、精神萎靡，真武汤组大鼠肾阳虚症状好转。真武汤较雌二醇组体重、睾丸指数明显升高（P0.05，P0.01），肾脏指数显著下降（P0.01）。真武汤组较雌二醇组大鼠的24小时 h尿蛋白定量明显下降（P0.05，P0.01）。真武

5、汤较雌二醇组体温、游泳时间明显升高（P0.05，P0.01）。肾组织HE、Masson染色结果显示，阿霉素组、雌二醇组大鼠肾小球系膜区增宽，系膜细胞增生，肾小管上皮细胞空泡样变，肾间质有炎性细胞浸润，系膜区有大量胶原纤维沉积；真武汤组病理损伤情况有所改善。血清指标显示：真武汤较雌二醇组Scr、BUN、TC明显下降（P0.05，P0.01）。从性腺轴指标来看，真武汤组较雌二醇FSH、LH、E2有降低趋势，T有升高趋势。从肾上腺轴指标来看，真武汤组较雌二醇组CORT差异不明显。从甲状腺轴指标来看，真武汤组较雌二醇组T4显著降低（P0.01）。真武汤组较雌二醇组SOD有升高趋势。结论： 阿霉素联合腹

6、腔注射雌二醇能够成功制备慢性肾脏病肾阳虚证动物模型。该大鼠模型主要模拟了慢性肾脏病下丘脑-垂体-性腺轴功能低下的肾阳虚证动物模型。真武汤可改善模型组大鼠的肾阳虚症状与性腺轴的抑制状态。关键词：阿霉素； 病证结合； 雌二醇； 动物模型； 慢性肾脏病； 肾阳虚证； 真武汤中图分类号：R285.5慢性肾脏病(（Chronic Kidney Disease, CKD)）是指有肾脏结构或功能损害3个月，估算的肾小球滤过率(（e GFR)）60 mL/(min1.73 m2)3个月1。CKD包括慢性肾功能衰竭、肾小球肾炎、肾病综合征、膜性肾病和糖尿病肾病等2。根据相关统计，在2017年，全世界有6.975

7、亿CKD患者，中国有1.323亿CKD患者3，并且CKD后期可引起各种并发症，严重危害人们的身体健康4。CKD多属于中医学的“水肿”“腰痛”“虚劳”“关格”等病的范畴5，发病机制错综复杂，多数病因为虚实相互夹杂，其中正虚为本，邪实为标，正气亏虚，感受外邪，两者相互影响，正虚邪实贯穿着本病的整个病程6。田海刚7在对200例慢性肾脏病患者证候分布规律研究中发现，其本虚证以脾肾阳虚证为主。目前有学者认为肾气的气化功能失调为CKD形成的根本原因。肾气是一身正气的根本，正气之中，阳气至关重要，人体阳气之本为肾阳，另外肾阳对于肾气的化生有着主导作用8。以此可见，肾阳虚证在慢性肾脏病中医辨证中占有重要地位。

8、肾阳，是人体阳气的根源，控制着人体的生长发育与生殖，又被称为命门之火，如果肾阳不足，温煦功能就会下降，则可能会导致虚寒衰弱诸症与生殖功能减退，患者易出现腰膝酸软，性欲减退，畏寒肢冷；精神萎靡，夜尿频多，下肢浮肿，动则气促，发槁齿摇，舌淡苔白，脉沉迟的一系列肾阳虚症状9,10。有研究证实，下丘脑-垂体-肾上腺轴、下丘脑-垂体-甲状腺轴、下丘脑-垂体-性腺轴发生功能紊乱就会导致肾阳虚证11。刘轲12发现“阳虚”雄性大鼠的下丘脑-垂体-性腺轴处于受抑制状态。苏洁等人9发现腹腔注射苯甲酸雌二醇可引起下丘脑-垂体-性腺轴功能异常。近年来，中西医结合研究采取西医辨病结合中医辨证的病证结合模式，这符合中医临

9、床的需求13，而“病-证”结合模型的构建是必不可缺的研究中医证候的基础14。目前，西医治疗CKD多以对症治疗为主，病情控制存在不足，有一定的局限性。中医药在预防CKD、延缓病程进展、减轻临床症状以及保护体内残余肾功能等方面具有独特的优势。真武汤出自伤寒论，主要作用是温阳利水，由附子、白术、茯苓、白芍和生姜五味药物组成，是临床上治疗慢性肾脏病的经典方子15。为了探索构建CKD肾阳虚证动物模型的合适方法，并阐释真武汤对本模型的干预作用，本课题组首次应用阿霉素联合雌二醇建立CKD肾阳虚证“病-证”结合的动物模型，给予真武汤进行干预治疗，从体征、客观指标、药物反证3个方面探讨本模型的可靠性以及真武汤的

10、干预作用。研究流程图见附图。1 材料1.1实验动物49只6-8周龄SPF级雄性SD大鼠，体重体质量22020 g；动物来源：北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SYXK（京）2017-0033；大鼠饲养在北京中医药大学良乡校区洁净动物房内，温度23-25，自由饮食、饮水，适应性喂养2周。1.2 试剂及仪器真武汤（附子20 g，生姜6 g，茯苓15 g、白术15 g、白芍各15 g，北京康仁堂药业有限公司提供）；盐酸阿霉素（上海源叶生物科技有限公司，批号：H11S10Y97261）；苯甲酸雌二醇（上海源叶生物科技有限公司，批号：Y12O6D4246）；玉米油（上海源叶生物科技有限公司，

11、批号：X28J10P91608）；液体样品总蛋白抽提试剂盒（普利莱基因技术有限公司，批号：2020A3AP1255）；BCA蛋白定量试剂盒（普利莱基因技术有限公司，批号：2019D0BP1511）；苏木素染液（Solarbio，批号：20190724）；伊红染液（Solarbio，批号：20190805）；Masson三色染色试剂盒（Solarbio，批号：20200630）；戊巴比妥钠（北京化学试剂公司，批号：020402）。JXB-180型红外体温计（广州倍尔康医疗器械有限公司）；L340099光学显微镜（Olympus）；Mikr002r离心机（Germany）；全自动生化仪（深圳迈瑞生

12、物医疗电子股份有限公司，迈瑞BS-420）；酶标分析仪（无锡华卫德朗仪器有限公司，华卫德朗DR-200BS）。2 方法2.1 动物模型构建与分组49只雄性SD大鼠予普通饲料、自由食水，进行适应性喂养，为期2周。随机分为正常组10只和模型组39只。实验第3周，模型组大鼠按照3 mgkg-1/kg剂量首次尾静脉注射阿霉素；实验第4周，模型组以相同的方法按照4 mgkg-1/kg剂量第二次尾静脉注射阿霉素（根据文献学习16以及前期预实验确定阿霉素的给药剂量），正常组大鼠按照5 mLkg-1/kg剂量尾静脉注射生理盐水。注射完成2周后，以24 h尿蛋白定量50 mg为慢性肾脏病大鼠模型成功构建的标准。

13、并以体重与24 h尿蛋白定量为依据进行分层随机法分组：阿霉素组13只、雌二醇组13只、真武汤组13只。第13周起，雌二醇组与真武汤组大鼠进行联合因素造模，腹腔注射雌二醇玉米油稀释液（4 mgkg-1/kg）；真武汤组大鼠造模的同时，给予真武汤灌胃给药，剂量为5.39 g/kg-1/d-1天（根据Meeh-Rubner氏公式17计算出大鼠给药量相当于成人临床给药量的4.56倍），给药体积为10 mLkg-1/kg；正常组、阿霉素组采用等体积去离子水灌胃；自由饮水，饮食，连续12周。2.2 观察指标2.2.1 大鼠一般情况每天观察大鼠毛发、饮食情况、活动度、精神情况等并做记录。2.2.2 大鼠体重

14、与脾脏、肾脏、睾丸指数的检测 每周称量并记录大鼠的体重。实验第24周，采用1%的戊巴比妥钠40mgkg-1/kg麻醉大鼠，摘取并以生理盐水冲洗肾脏、睾丸、脾脏，然后称量其重量，计算脏器指数（脏器指数脏器质量/体质量）。2.2.3 大鼠24 h尿蛋白定量的检测每4周用代谢笼收取大鼠的24 h尿液，用BCA蛋白定量试剂盒检测尿蛋白浓度，计算大鼠24h尿蛋白定量。2.2.4 大鼠体温检测每4周使用红外测温枪将测温孔对准大鼠尾根部位，待读数稳定后记录，连测3次，取中间值。2.2.5 大鼠游泳耐力实验实验第24周，在80 cm100 cm塑料桶内加深为50 cm的洁净温水，水温为23-25，分组放入大鼠

15、并计时，从大鼠进入水内到其头部沉入水中10s未能浮出水面的时间为大鼠游泳时间。2.2.6 大鼠肾脏病理学检查实验第24周，麻醉大鼠后，摘取肾脏，制备石蜡切片。采用HE和Masson染色观察大鼠肾组织的病理变化情况。2.2.7 大鼠血清生化指标检测实验第24周，大鼠股动脉取血，血液静置2 h后进行离心，离心条件为：2500 rpmmin-1/min，4，20 min，分离好的上层血清，保存在-80冰箱。用比色法检测血清Scr、UA、BUN、TP、ALB、TC、TG的含量；用酶联免疫法检测血清CORT、FSH、LH、T、E2、T3、T4、TSH、SOD的含量。2.2.8 统计学方法使用SPSS 2

16、3软件进行统计，数据用xS表示。组间比较用单因素方差分析的方法，依据是否服从正态分布及方差齐性原则分别选择LSD检验及Dunnetts T3法检验。=0.05，P0.05，表示差异有明显统计学意义；P0.01，表示差异有显著统计学意义。3 结果3.1 大鼠一般情况模型组大鼠经尾静脉注射阿霉素后，逐渐出现双下肢水肿，毛色暗淡、体重下降。实验第12周腹腔注射雌二醇后，大鼠出现肾阳虚体征：消瘦、毛发光泽度低、弓背、懒动、蜷缩、精神萎靡；真武汤组大鼠较雌二醇组大鼠肾阳虚状态好转。其中阿霉素组死亡4只、雌二醇组死亡2只，真武汤组死亡6只。3.2 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠体质量以及肾脏、脾脏、睾丸指

17、数的影响与正常组比较，阿霉素组、雌二醇组、真武汤组大鼠体重明显下降（P0.05，P0.01）。实验第16周与24周，与阿霉素组比较，雌二醇组、真武汤组大鼠体重显著下降（P0.01）。实验第16周、20周与24周，与雌二醇组比较，真武汤组大鼠体重明显升高（P0.05，P0.01）（表1、图1）。与正常组比较，阿霉素组、雌二醇组大鼠肾脏指数显著升高（P0.01）；与雌二醇组比较，真武汤组大鼠肾脏指数明显下降（P0.05）。脾脏指数各组大鼠差异不明显，差异无统计学意义（P0.05）。与正常组与阿霉素组比较，雌二醇组大鼠睾丸指数显著下降（P0.01）；与雌二醇组比较，真武汤组大鼠睾丸指数明显升高（P0

18、.05）（表2、图2）。表1 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠体质量的影响(（xS，g)）组别n第4周第8周第12周第16周第20周第24周正常组10468.104.416506.808.338533.007.115556.407.891571.806.621593.307.836阿霉素组7408.0012.261441.2914.516462.5719.039497.2919.076477.1433.184532.2928.656雌二醇组7412.869.515444.1415.514476.716.711367.719.621369.7118.12414.2924.304真武汤组7408.5

19、712.195439.8616.36466.2911.218407.2913.444444.8613.015494.1415.018F11.4837.099.65450.13722.48816.639注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01图1 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠体质量的影响注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01表2 真武

20、汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠脏器指数的影响（xS）组别n肾脏（%）脾脏（%）睾丸（%）正常组100.6310.0250.1560.0050.6510.022阿霉素组70.8220.0550.1420.0130.6720.041雌二醇组70.8430.0520.1560.0060.4280.016真武汤组70.6980.0630.1830.0140.6210.048F4.8742.91211.025注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组

21、比较P0.05，P0.01图2 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠脏器指数的影响注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.013.3 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠24h尿蛋白定量的影响与正常组比较，阿霉素组、雌二醇组、真武汤组大鼠24 h尿蛋白定量显著升高（P0.01）。实验第20周与24周，与阿霉素组与雌二醇组比较，真武汤组24 h尿蛋白定量明显下降（P0.05，P0.01）（表3、图3）。表3 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠24 h尿蛋白定量的影响（xS，mg）组别n第4周第8周第12周第16周第20周第24周正常组1024

22、.5651.54027.7221.85130.6802.28128.0632.50728.3893.51923.8263.075阿霉素组753.9977.69858.7313.779105.0827.486141.08510.054156.5457.897208.58910.096雌二醇组749.6775.89163.2156.537108.1969.065142.1419.203161.43210.021212.1289.311真武汤组751.6827.42860.6346.96096.8489.315111.4777.079120.1067.098141.1547.205F7.06514.

23、26732.92366.01490.183167.136注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01图3 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠24h尿蛋白定量的影响注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.013.4 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠体温与游泳时间的影响第16周、20周与24周，与正常组比较，阿霉素组、雌二醇组、真武汤组大鼠体温明显降低（

24、P0.05，P0.01）；第16周，与阿霉素比较，雌二醇组体温明显降低（P0.05）；第24周，与雌二醇组比较，真武汤组体温明显升高（P0.05）（表4、图4）。与正常组比较，阿霉素组、雌二醇组大鼠游泳时间显著下降（P0.01）；与阿霉素组与雌二醇组比较，真武汤组大鼠游泳时间显著升高（P0.01）（表4、图5）。表4 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠体温与游泳时间的影响(（xS)）组别n体温（）游泳时间（s）第12周第16周第20周第24周正常组1033.3200.05133.6100.20133.7600.16733.3000.111875.00048.417阿霉素组733.1710.0993

25、2.5570.06932.4570.07232.8000.123421.25063.814雌二醇组733.3860.17032.2140.08032.7140.11432.5000.087367.00064.113真武汤组733.3430.21433.5290.42432.6860.09632.9430.141746.000100.703F0.4358.74922.3798.64311.816注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比

26、较P0.05，P0.01图4 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠体温的影响注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01图5 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠游泳时间的影响注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.013.5 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠肾脏病理的影响HE染色结果显示：与正常组比较，阿霉素组、雌二醇组大鼠肾小球系膜区增宽，系膜细胞增生，

27、肾小管上皮细胞空泡样变，肾间质有大量炎性细胞浸润。真武汤组大鼠肾小球系膜细胞轻度增生，肾间质有少量炎性细胞浸润。见（图6）。Masson染色结果显示：与正常组比较，阿霉素组、雌二醇组大鼠肾小球系膜区有大量胶原纤维沉积，真武汤组大鼠肾小球系膜区少量胶原纤维沉积。见（图7）。正常组阿霉素组雌二醇组真武汤组图6 肾组织HE染色（400）正常组阿霉素组雌二醇组真武汤组 图7 肾组织Masson染色（400）3.6 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠血清Scr、UA、BUN水平的影响与正常组比较，阿霉素组大鼠血清BUN水平显著升高（P0.01）；雌二醇组大鼠血清Scr、BUN水平明显升高（P0.05，P0.

28、01）。与雌二醇组比较，真武汤组大鼠血清Scr、BUN水平明显降低（P0.05，P0.01）（表5、图8）。表5 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠血清Scr、UA、BUN水平的影响（xS）组别nScr(（umol/L-1)）UA(（umolL-1/L)）BUN(（mmolL-1/L)）正常组634.9921.51562.8282.2784.4710.269阿霉素组641.8723.55071.0388.8057.1280.262雌二醇组646.9073.00973.8565.5647.7600.481真武汤组631.4543.73557.5169.1895.6450.495F5.0531.136

29、14.229注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01图8 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠血清Scr、UA、BUN水平的影响注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.013.7 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠血清TC、TG、TP、ALB水平的影响与正常组比较，阿霉素组、雌二醇组大鼠血清TC、TG水平明显升高（P0.05，P0.01），ALB水平

30、明显降低（P0.05，P0.01）。与雌二醇组比较，真武汤组大鼠血清TC水平明显降低（P0.05）（表6、图9）。表6 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠血清TC、TG、TP、ALB水平的影响（xS）组别nTC (（mmolL-1/L)）TG (（mmolL-1/L)）TP（gL-1/L)）ALB（gL-1/L)）正常组61.1550.0610.3430.00757.1371.80518.7450.601阿霉素组62.3250.2901.2790.11855.8913.17713.3841.849雌二醇组62.5180.3021.4910.20348.1774.72610.0451.630真武汤组

31、61.2940.2140.9410.17750.1854.80314.2761.697F8.65911.5841.2845.520注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01图9 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠血清血脂、蛋白水平的影响注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.013.8 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠血清FSH、LH、T、E2水平

32、的影响与正常组比较，阿霉素组与雌二醇组大鼠血清T水平显著降低（P0.01），雌二醇组大鼠血清E2水平显著升高（P0.01）；与阿霉素组比较，雌二醇组大鼠血清LH、E2水平明显升高（P0.05，P0.01）（表7、图10、图11）。表7 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠血清FSH、T、LH、E2水平的影响（xS）组别nFSH (（mIUmL-1/mL)）LH (（mIUmL-1/mL)）T (（ngmL-1/mL)）E2 (（pgmL-1/mL)）正常组618.1300.7396.9980.1952.1900.34070.6680.725阿霉素组614.4300.3285.5580.1300.92

33、70.38144.1771.726雌二醇组623.6822.4298.3800.5800.4360.0793613.564425.882真武汤组622.8702.0727.6040.6610.6810.3062994.690692.446F6.8976.8786.75421.654注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01图10 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠血清FSH、LH水平的影响注：与正常组比较P0.05

34、，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01图11 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠血清T、E2水平的影响注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.013.9 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠血清CORT、T3、T4、TSH和SOD水平的影响与正常组比较，阿霉素组大鼠血清T4、SOD水平显著降低（P0.01），T3、TSH水平显著升高（P0.01）；雌二醇组大鼠血清SOD水平

35、显著降低（P0.01）。与阿霉素组比较，雌二醇组大鼠血清T3、TSH水平显著降低（P0.01），T4、SOD水平显著升高（P0.01）。与雌二醇组比较，真武汤组大鼠血清T4水平显著降低（P0.01）（表8、图12、图13）。表8 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠血清CORT、T3、T4、TSH和SOD水平的影响（xS）组别nCORT (（gL-1/L)）T3 (（ngmL-1/mL)）T4 (（ngmL-1/mL)）TSH (（uIUmL-1/mL)）SOD (（UmL-1/mL)）正常组641.2053.6290.4480.00359.1041.0304.470.10495.9570.958阿

36、霉素组640.4522.9880.5690.01628.9931.12310.0450.15735.2861.163雌二醇组646.6233.4530.4130.01154.2632.6484.5570.57763.8892.124真武汤组648.9353.0320.4480.01729.2732.1597.2011.20276.2093.834F1.58228.70073.42915.384120.165注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01

37、；与雌二醇组比较P0.05，P0.01图12 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠血清CORT、SOD水平的影响注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.01图13 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠血清T3、T4、TSH水平的影响注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与雌二醇组比较P0.05，P0.014 讨论阿霉素肾病模型为经典肾病综合征模型，Bertani T在1982年首先报道

38、了此模型18，通过对大鼠尾静脉一次性注射阿霉素7.5 mgkg-1/kg，肾病综合征于13-至15d15天后出现，病理损害属于微小病变。阿霉素原是一种广谱抗肿瘤药物，由于其毒副作用明显，尤其对于肾脏的损伤较大，被广泛用于慢性肾脏疾病的动物模型的构建。它可以从DNA水平上阻碍足突细胞蛋白合成，导致肾脏足突细胞结构破坏19。同时也会刺激炎性因子的产生，致使肾小球系膜区基质及细胞增生，最终导致肾小球硬化及滤过膜破坏，导致蛋白尿20。结合文献学习21与本课题组前期工作22，本实验采取间隔一周分两次尾静脉注射阿霉素制备慢性肾脏病动物模型。根据文献报道23,24，阿霉素对心脏、消化道有毒副作用，一次性尾静

39、脉注射7.5 mgkg-1/kg 1周后，大鼠出现严重心力衰竭、腹泻的症状，增加了大鼠的死亡率，降低了造模的成功率。李明等人16制备阿霉素肾病模型，第一周予阿霉素4 mgkg-1/kg尾静脉注射, ，第4周再次注射3 mgkg-1/kg。为了降低阿霉素的毒副作用，本实验采取间隔一周分两次给药，分别于造模第1、8天尾静脉注射阿霉素3 mgkg-1/kg、4 mgkg-1/kg，累加剂量为7 mgkg-1/kg，减轻对其它脏器的损伤，降低死亡率。本次实验结果显示，阿霉素模型组24 h尿蛋白定量明显高于正常组，且24 h尿蛋白定量50 mg25，说明慢性肾脏病大鼠模型复制成功；大鼠血清指标检测结果显

40、示，阿霉素肾病模型组Scr、UA、BUN、TC、TG升高，TP、ALB下降，说明肾功能、血脂、蛋白指标异常。肾组织HE、Masson染色结果显示，阿霉素组、雌二醇组大鼠肾小球系膜区变宽，系膜细胞增生，系膜区大量胶原纤维沉积，肾小管上皮细胞发生空泡样变，肾间质有大量炎性细胞浸润。以上实验结果表明，阿霉素模型组大鼠的24h尿蛋白定量，血清肾功能、血脂、蛋白指标以及肾脏病理均符合慢性肾脏病的评价标准。由此认为，慢性肾脏病模型已成功建立。本文从症状（本证）、客观指标（佐证）、治疗（反证）这三个方面对肾阳虚证大鼠模型进行评价26。一是症状（本证），我们以中医虚证辨证参考标准27为依据判断证侯模型是否成立

41、，其中肾阳虚证动物模型主要是依靠其一般状态来诊断。结合既往文献研究，主要的症状表现为体质量及体温下降、行动及反应均迟缓、弓背蜷缩、毛发无光泽且稀疏、食水减少及畏寒28。二是客观指标，沈自尹院士29认为下丘脑-垂体-靶腺（肾上腺、甲状腺、性腺）轴出现不同环节、不同程度的功能紊乱可引起肾阳虚证。肾阳虚证雄性大鼠血清T含量降低，LH、FSH升高30；CORT水平下降31；肾阳虚证小鼠血清T3和T4均降低，TSH升高32。肾阳虚证大鼠血清SOD活力降低33。三是治疗（反证），中医从证效关系来判断辨证是否正确，也就是以药验“证”，用反证方剂来评价动物模型是否成功是目前常用的方法。有研究表明34，真武汤加

42、减能有效控制和延缓慢性肾脏病阳虚水肿型患者的病情，改善肾功能，增强机体免疫力。本次实验对大鼠短期内腹腔注射一定量雌二醇引起雄性大鼠雌二醇激素水平骤升，影响性腺结构及功能10。可体现下丘脑-垂体-性腺轴的功能紊乱所致肾阳虚证的特点。从大鼠一般情况来看，与正常组比较，雌二醇造模大鼠出现毛发光泽度低、弓背蜷缩、消瘦，体重降低，体现了肾阳虚的状态；睾丸指数降低，符合肾阳虚证的性欲冷淡，生殖之力下降35；游泳时间减少，符合肾阳虚证的腰膝酸软，腰膝酸软因肾主骨，而寒凝于肾致痛所致10；体温降低，与中医的“阳虚则寒”相符合；活动减少，精神萎靡，符合“阳主动，阴主静”。从客观指标来看，雌二醇组大鼠性腺轴指标E

43、2明显高于正常组，T明显低于正常组，FSH、LH与正常组比较差异无统计学意义，但是有升高趋势，说明大鼠性腺轴激素分泌量发生了变化，生殖内分泌系统紊乱；肾上腺轴指标CORT与正常组比较差异不明显；甲状腺轴指标T3、T4、TSH与正常组比较均差异不明显；血清SOD水平明显低于正常组。本实验结果显示：真武汤能使雌二醇组大鼠的一般情况、24h尿蛋白得到改善，体重、睾丸指数、体温升高，游泳时间延长，肾脏指数降低，并且改善雌二醇组大鼠的病理情况与血清指标。综合评价说明，采取腹腔注射雌二醇制备的肾阳虚证大鼠模型，符合中医肾阳虚证体征，其性腺轴指标异常，但是未见肾上腺轴、甲状腺轴指标有变化，说明雌二醇能较好的

44、模拟出下丘脑-垂体-性腺轴异常所致肾阳虚动物模型，还不能认为雌二醇对肾上腺轴、甲状腺轴功能有影响。本次实验肾阳虚证动物模型造模周期为12周，相对于其它文献中造模时间较长，原因为本课题组致力于寻找肾阳证模型造模最佳时间。本实验也存在一些问题，在制备肾阳虚证大鼠模型过程中，出现了腹腔积水、感染现象，并且雌二醇模型组体重严重下降，可能是由于大鼠不能完全吸收稀释雌二醇所用的玉米油，出现腹腔积水与感染现象，致使模型组大鼠出现体重严重下降、死亡率高。综上所述，本实验首次通过尾静脉注射阿霉素联合腹腔注射雌二醇造模方法构建下丘脑-垂体-性腺轴功能异常的慢性肾脏病肾阳虚证“病证”结合的大鼠模型，给予真武汤进行干

45、预治疗，并从体征、客观指标、药物反证这三个方面综合评价其模型特点，验证了此模型的可行性与科学性，为“肾阳虚证”辨证标准及“肾阳虚型慢性肾脏病”辨证标准的建立提供研究方法，为进一步揭示慢性肾脏病“肾阳虚证”实质奠定基础，对于慢性肾脏病肾阳虚证新药的开发和中医药现代化研究具有重要的意义。参考文献Andrassy K M. Comments on KDIGO 2012 clinical practice guideline for the evaluation and management of chronic kidney diseaseClinical Practice Guideline fo

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55、h尿蛋白定量50mg为CKD造模成功；模型组按照体重与24h尿蛋白定量进行随机分组雌二醇组真武汤组阿霉素组正常组 血清生化指标检测：Scr、BUN、UA、ALB、TC、TG、TP、FSH、LH、T、E2、CORT、T3、T4、TSH、SOD肾组织病理学检查：HE染色、Masson染色大鼠一般状态，24h尿蛋白定量，体重与肾脏、脾脏、睾丸指数，体温，游泳时间 阿霉素联合腹腔注射雌二醇能够成功制备慢性肾脏病肾阳虚证动物模型，该大鼠模型主要模拟了慢性肾脏病下丘脑-垂体-性腺轴功能低下的肾阳虚证动物模型，真武汤可改善模型组大鼠的肾阳虚症状与性腺轴的抑制状态附图 阿霉素联合雌二醇诱导慢性肾脏病肾阳虚证大

56、鼠模型的建立与评价及真武汤干预作用研究 流程图Establishment and Evaluation of Rat Model of Kidney-Yang Deficiency Syndrome Induced by Adriamycin and Estradiol and the Intervention Effect of Zhenwu Decoction*Zhang Mengmeng, Zhang Xinxue, Zheng Pengfei, Wu Yingjie, Wu Qi, Yang Tao, Zhao Zongjiang*（(School of Chinese Medicin

57、e, , Beijing University of Chinese Medicine,l, , Beijing 102488, , China）)Abstract: Objective:Objective tTo explore the establishment and evaluation criteria of animal model of kidney yang deficiency syndrome of chronic kidney disease and the intervention effect of Zhenwu decoctionDecoction. Methods

58、: Forty-nine male SD rats were fed adaptively for 2 weeks, and randomly divided into normal group (n = 10) and model group (n = 39). Model group rats were injected with adriamycin 3 mgkg-1/kg and 4 mgkg-1/kg through tail vein at week 3 and week 4, , respectively, , to establish the animal model of c

59、hronic kidney disease. The model rats were randomly divided into adriamycin group (n = 13), , estradiol group (n = 13) and Zhenwu Tang Decoction group (n = 13). . From week 13, , the estradiol group and Zhenwu DecoctionTang group were intraperitonealintritoneally injected with estradiol corn oil dil

60、uent (4mgkg-1/kg) to establish the animal model of chronic kidney disease and kidney Yang syndrome combined with disease and syndrome. . The Zhenwu Decoction Tang group was given 5.39gkg-1d-1 by gavage. The general condition of rats was observed. The body weight of rats was weighed every week, , and