本科《食品生物技术导论》课件第三章 细胞工程与食品产业-2002-

1、第三章 细胞工程与食品产业Cell Engineering & Food Industry生吉萍2002.9.26评说地位和作用：=基因工程细胞工程：对生物的基本单位-细胞的离体培养、繁殖、再生、融合，以及细胞核、细胞质乃至染色体与细胞器的移植与改建等操作技术。主要内容：细胞培养、细胞融合、细胞重组、遗传物质的转移等。第一节 细胞工程的基本原理与操作1.1 细胞工程的分类植物细胞动物细胞 工程微生物细胞植物细胞动物细胞微生物细胞1.2 细胞的生命特征严格的结构 (strict structure)新陈代谢 (metabolism)生长现象 (growth)自我复制(self-replicati

2、on)-植物细胞的全能性(totipotency)；动物细胞？细胞的生命特征(续)应激性(emergency)：对刺激发生的反应遗传和变异 (heredity & aberrance )适应环境的能力 (acclimation)1.3 细胞工程的基本操作无菌操作技术细胞培养技术细胞融合技术无菌操作技术所有实验都要求在无菌条件下进行！如何做到？1）无菌室应定期用紫外线或化学试剂消毒，实验前后还应各消毒一次。2）无菌室外有间缓冲室，实验人员在此换鞋、更衣、戴帽，做好准备后方可进入无菌室，操作时实验者的双手应戴无菌手套。3）注意周围环境的卫生整洁。如何做到？4）超净工作台是最基本的实验设备，一切操作

3、都应在超净台上进行才能达到较高的无菌要求。5）对生物材料进行彻底的消毒与除菌是实验成功的前提，实验所用的一切器械、器皿和药品都应进行灭菌或除菌。第二节 细胞培养技术1、定义：是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长的技术。 2、基本过程取材和除菌。淋巴细胞-直接抽取；动植物材料在取材前后，表面清洗、消毒。（有时还需要某些特定的酶对材料进行预处理，以期得到分散生长的细胞。）根据各类细胞的特点，配制细胞培养基并进行灭菌。将生物材料接种于培养基。将接种后的培养基放入培养室或培养箱中培养。当细胞达到一定生物量时应及时收获或传代。 3、 微生物细胞培养技术3.1培养基的组成 碳源 氮源 无

4、机盐 维生素 3.2培养基的种类 （1）按成分不同划分为： 天然培养基(complex medium) 合成培养基(synthetic medium) （2）根据物理状态划分 固体培养基(solid medium) 半固体培养基(semisolid medium) 液体培养基(1iquid medium) （3） 按用途划分基础培养基(minimum medium) 加富培养基(enrichment medium)，也称营养培养基。鉴别培养基(Differential medium)选择培养基(selective medium) 其他培养基3.3培养方法（1）固体培养（solid-state

5、culture） （2）液体培养（liquid-state culture） （3）连续培养（continuous culture（4）中间补料培养(fed-bath culture)（5）同步培养（Synchronous culture ）（6）混合培养（Mixed culture） 4. 植物细胞培养4.1 植物细胞培养技术在无菌条件下，将离体的单个游离细胞在人工控制的环境里培养,以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他生物产品的一种技术。 原理植物细胞的“全能性”-给予适宜的条件可以增殖与分化形成一棵完整植株的能力。4.2植物细胞体系的建立一般程序为： 整体植株-植物组织或器官-外植

6、体-在固体培养基上诱发愈伤组织-愈伤组织继代培养-悬浮培养or其他培养方式。 外植体（explant）:用来进行组织培养的植物部分。愈伤组织(callus):外植体在组织培养过程中形成的不定形的细胞团。4.3植物细胞培养基组成无机盐类碳源维生素植物生长激素有机氮源有机酸一些复合物质组成。包括植物生长所必需的16种营养元素和某些生理活性物质。植物生长激素大多数植物细胞培养基中都含有天然的或合成的植物生长激素，激素分为两类：生长素和分裂素。生长素促进细胞生长：吲哚乙酸和萘乙酸。分裂素促进细胞分裂：腺嘌呤衍生物。使用最多的是6-苄氨基嘌呤和玉米素。分裂素和生长素通常一起使用，来促进细胞的分裂、生长。

7、复合物质这些物质通常作为细胞的生长调节剂。它们有酵母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁。 培养基的种类在植物细胞培养中，选择好的培养基是细胞培养成功的关键，常用的培养基有几十种。如MS、B5、E1、N6培养基等。其中以MS、B5等应用较为广泛。 4.4 植物细胞培养的方法（10.8）单细胞培养、原生质体培养；固体培养、液体培养 摇瓶悬浮培养和大规模悬浮培养 是指把离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养。 摇瓶悬浮培养注意事项选择合适的外植体诱导疏松易碎的愈伤组织选择合适的培养基培养液的灭菌悬浮培养悬浮细胞的继代与选择摇瓶悬浮培养方法分批培养：在新鲜的培养基中加入少量的细胞培养。（有诱导

8、期、对数期、稳定期和死亡期）半连续培养法：在反应器中投料和接种培养一段时间以后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换。连续培养法在反应器中投料和接种培养过程中，不断抽取悬浮培养液，注入等量的新鲜培养液的培养方法。4.5花粉培养过程：无菌条件下取出花药或从花药中取出花粉粒-置于人工培养基上-形成花粉胚或愈伤组织-花粉植株（单倍体）4.6 原生质体培养过程：纤维素酶或果胶酶除去细胞壁-原生质体-培养基-愈伤组织-诱导出叶、茎、根-完整植株原生质体培养的应用1）提高变异频率2）为应用细胞工程技术进行遗传重组提供材料，细胞融合和基因转移的基础。5、动物细胞培养5.1 定义 动物细胞培养是指离散的动物活细胞

9、在体外人工无菌条件下的生长增殖，在整个过程中细胞不出现分化，不再形成组织。 5.2 培养类型根据细胞是否贴附于支持物上生长的特性，培养的细胞可分为两大类：悬浮型和贴附型。悬浮型细胞是指生长时呈悬浮状态的细胞;贴附型是指贴附于支持物上生长的细胞。 5.3 培养基的成分氨基酸 维生素盐类葡萄糖有机添加剂。如：核苷、柠檬酸循环中间体、丙酮酸、脂类及其他各种化合物。 激素和生长因子等。如：血清（小牛血清、胎牛血清、人血清）。5.4 培养过程原料（动物胚胎或幼龄动物的脏器、肌肉组织）-剪碎-胰蛋白酶消化为单细胞-洗涤-稀释-分装-培养（37，CO2）几个名词从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养，称为

10、原代培养(primary culture).细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程，称为传代(subculture)。进行一次分离再培养，称为传一代，初次培养的首次传代成功后，即成细胞系，一般可传30-50代。细胞系的维持，就是通过换液、传代、再换液、再传代实现的。细胞系的保存一般进行冰冻。5.5 应用动物细胞培养生产：疫苗干扰素激素其他免疫试剂等。第三节 细胞融合技术 Cell Fusion Technology1、定义：在一定条件下，将两个或多个细胞融合为一个细胞的过程。细胞融合，又称细胞杂交。 动物细胞可以直接融合植物细胞、微生物细胞去壁-原生质体（protoplast）-融合原

11、生质体的融合2. 细胞融合过程促融因子作用下-细胞凝集-细胞质膜粘连-细胞质融合-培养过程中发生核融合-杂种细胞物种间杂交、种内杂交-基因重组-育种-优良品种3. 细胞融合的方法 1）生物学法：采用病毒促进细胞融合。如仙台病毒、疱疹病毒、天花病毒等，能诱导细胞融合。2）化学融合法：采用化学融合剂使细胞融合。如PEG（聚乙二醇）、DMSO（二甲亚砜）、甘油酸酯等。钙离子参与。3）电融合法：电场脉冲刺激，使细胞膜透性增加，促进融合。4、微生物原生质体融合1）微生物去壁处理：酶法，G+：溶菌酶，G-：溶菌酶+EDTA酵母菌：蜗牛酶Helicase丝状真菌：纤维素酶，纤维素酶+蜗牛酶霉菌：壳聚糖酶+其

12、他酶（如纤维素酶）2）融合：PEG融合or电融合3）培养：高渗培养基4）检验重组菌株。5、植物细胞融合过程细胞分离-原生质体制备-原生质体融合-杂种细胞筛选以及培养-愈伤组织-分化根、茎、叶-完整杂种植株植物原生质体融合1）原生质体制备取材与除菌-酶解-分离-洗涤-鉴定2）融合： 化学融合or电融合3）培养：含有渗透压稳定剂的medium培养，产生细胞壁，转移到生芽、生根medium上，再生植株。4）鉴定显微镜鉴别：大小、颜色等。互补法筛选杂合细胞：生长互补、抗性互补、营养缺陷型互补等方法。细胞生物学与分子生物学方法：染色体核型分析、染色体显带分析、同工酶分析、核酸分子杂交、限制性内切酶片段长

13、度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）分析等。植株的形态特征鉴别：高矮、大小、产量、颜色等。6、动物细胞融合动物细胞-融合-杂种细胞-筛选与鉴定-杂种细胞克隆筛选方法：药物抗性、营养缺陷型、温度敏感性等。第四节 细胞重组Cell Recombination：在生物体外，运用一定的实验技术从活细胞中分离出各种细胞的结构或组成“部件”，再把他们在不同的细胞中重新进行装配，成为具有生物活性的细胞。1、核移植小鼠的核移植实验2、细胞器转移1）叶绿体移植-高光合作用植物2）线粒体转移-得到线粒体基因的遗传特性，如抗药性、雄性不育性等。第五节 遗传物质的转移1、载体法：农杆菌、PLASMID、PHAGE，2、直接导入法：微注射法、基因枪、电激导入法、激光导入法、花粉管导入法等。第六节 动植物细胞工程的应用举例1、动物细胞工程至今动物细胞体外培养株