免疫荧光技术交流

1、免疫荧光（所有的步骤仅为个人意见，仅供参考）从切片完成之后开始免疫实验荧光器材避光场所，湿盒，烘箱等加温设备，吸水的纸，移液枪，1.5ml EP管，微 波炉，抗原修复用的容器，ph试纸或ph仪，盖玻片，多聚赖氨酸包被的载玻片 等免疫荧光实验试剂一抗荧光二抗Hoechst 33342 （与双链DNA结合，显核，蓝荧光）抗体稀释液（含1%BSA的PBS）10XPBS（NaCl 42.5g,NaH2PO42H2O1.482g, Na2HPO412H2O14.5055g，定容至500ml，配完最好高压灭菌一下）。PBS （10XPBS稀释10倍，再调ph至7.2-7.4。用得可快了）。10X柠檬酸盐抗

2、原修复液（C6H8O7-H2O2g， Na3C6H5O72H2O11.8g，定容至500ml，配完最好高压灭菌一下）。柠檬酸盐抗原修复液（10X柠檬酸盐抗原修复液稀释10倍，再 调 ph 至 6.0）。封片剂（0.672gNaHCO3加40ml蒸馏水（其为0.2mol/L），以1mol/L的NaOH调其ph至9.0 左右（NaOH加0.75ml左右吧）。吸取1ml此液体，与1ml 100%甘 油混匀即可）蒸馏水免疫荧光程序：包埋好的标本用切片机切石蜡切片（2微米），并将蜡片贴附于多聚赖氨酸处 理过的载玻片上（可购买，我用的是北京中衫的，从不掉片）。经60C烘片2-8小时（都试过，没啥差别，但非

3、实质性器官应适当延长时 间）。二甲苯I脱蜡4分钟（若要保证脱蜡完全可将其加热至40-60C），二甲苯 II脱蜡6分钟。梯度酒精复水：100%酒精1分钟，95%酒精1分钟，75%酒精1分钟（这个梯 度是没问题的，而且都是现成的医用酒精，不用配制），蒸馏水2分钟，PBS 2 分钟X2次。进行抗原修复：将切片置于0.1mol/L且ph=6.0的枸橼酸液修复液中，用微 波炉中火加热6分钟至微微沸腾，再用中低火力维持10分钟，停止加热后自然 冷却20-30分钟（我想还是煮沸6分钟X4次更好）。PBS浸洗2分钟后滴加0.3%tritonX-100透膜剂透膜12分钟（不透膜也没 关系，反正细胞早就被切开了）

4、。但注意细胞膜表面的整合蛋白不能加 tritonX-100,否则会被洗掉。用PBS 2分钟X2次洗去透膜液，用滤纸擦去标本外的PBS,滴加封闭血清 （无色的10%FBS或免疫组化试剂盒北京中衫中的封闭液）在湿盒中37C封闭 30分钟（室温30分钟也可）。用滤纸擦去封闭液，勿洗。滴加适宜浓度的一抗置湿盒中4C孵育过夜（37C1小时多也差不多），再用PBS 3分钟X5次洗去一抗，用滤纸擦去标本 外的PBS。滴加荧光二抗室温置湿盒中避光孵育1-1.5小时，此时可在荧光显微镜下迅 速观察是否着染，以确定终止时间。用PBS3分钟X3次洗去二抗，用滤纸擦去 标本外的PBS。滴加Hoechst33342避光

5、孵育2分钟，可对标本进行显核，蓝色荧光，效果 极佳。用PBS 1分钟X3次洗去Hoechst 33342，用滤纸擦去标本外的PBS。最后用含抗荧光淬灭剂的封片液碧云天封片（可自配），并在荧光显微镜 下立即观察。照相后可用photoshop将同一视野下不同的荧光图像叠加，效果不错，有一篇 参考文献支持。注：若一张切片同时做两种抗体的免疫荧光，则加一抗时可将两种一抗按各 自所需的浓度混合，但要注意抗体要来源于不同的动物。加二抗时也可将两种二抗 按各自所需的浓度混合，但要注意二抗要有不同的颜色。1直接免疫荧光法的操作步骤标本的处理：石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PB

6、ST漂洗5min x 3/次；2%BSA 或 10%BSA 37 C 湿盒内封闭 30min抗体染色：-C孵育30min；。在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体（1:8或1:16稀释），放在湿盒中，370.0lmol/L PBS（pH 7.4）漂洗5min x 3/次，不时震荡（洗去多余游离的荧光素标记的抗体）。缓冲甘油封片-分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2, 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。镜检：在荧光显微镜下观察。优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的 荧光标记抗体。直接免疫荧光法的注意事

7、项目对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度；一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；-染色时间：从10 min到数小时，一般30 min；-C的低温，延长染色时间。C可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2。0, 高于37。染色温度：多采用室温（25-C 30 min效果好的多。低温染色过夜较37试验时需设置下列对照：-自发荧光对照（空白对照）：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。-阳性对照：用巳知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。-特异性对照（

8、抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性 染色。一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。2间接法又称为荧光抗-抗体法需要两种抗体参与，即一抗和二抗（荧光素标记一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记 的二抗来说又起着抗原作用。中-可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。间接免疫荧光法操作步骤K标本的处理及非特异染色的封闭同直接法；一抗染色：-C过夜。C作用30min或4。加未标记的

9、特异性抗体（通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释），370.01M PBST漂洗5minx3次（震荡漂洗）；C湿盒避光作用30min。加荧光标记的二抗抗体，370.01M PBST避光漂洗5minx3次（例如包上锡纸，在摇床上漂洗）；甘油缓冲液封片镜检优点：敏感性较高，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，可应用于多种一抗；缺点：是参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多。间接免疫荧光法的注意事项荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4C保存4h,时间过长，会使荧光减弱。每次试验时，需设置以下三种对照：-阳性对照：阳性血清+荧光标记物-阴性对照：阴性血清+荧光标记物

10、-荧光标记物对照：PBS+荧光标记物标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。一抗和二抗应始终保持在标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。石蜡切片顺序乙醇脱水二甲苯脱蜡0.03%双氧水消除内源性过氧化物酶活性（或甲醇液：主要防止含血量多的标本）室温孵育10MIN蒸馏水冲洗一次PBS浸泡5MIN抗原修复0.4%胃蛋白酶（0.4g胃蛋白酶+0.1N HCL 100ml ）溶液预先预热至37度切片也预热至37 度20MIN,也可选择抗原微波热修复PBS 洗片 3*5MIN消除非特异性背景染色：滴加正常山羊血清封闭液（PBS稀释）室温20MIN甩去液体，无需再洗片滴加

11、一抗：4度过夜，之后37度复温30MIN或37度孵育一小时PBS洗片3*5MIN6.滴加荧光素标记的二抗37度孵育30MINPBS 洗片 3*5MIN注意一抗 二抗孵育后PBS洗片可适当时间长些，洗去未结合的荧光二抗.甘油缓冲液封片镜检取0.5mol/L PH8.5碳酸盐缓冲液1份，分析纯甘油9份免疫荧光中的重要环节/1、冰冻切片制备建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织 一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。2、组织切片固定切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10 min，尤其要较长时间保存的白片，一 定要及时固定和适当保存。3、血清封闭为防

12、止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封 闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30 min。4、一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、 37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2 h，而4 度过夜和从冰箱拿出后37度复温45 min。具体条件还要摸索。5、二抗孵育条件二抗一般室温或37度30 min-1 h,具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液 还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下， 然后去摸索一

13、抗浓度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有 大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。6、复染目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。7、封片为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生 气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿 对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触 面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。8、切片清洗为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加

14、强清洗（延长时间和增 多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3 min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5 次*5 min。注意（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。 我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的PH 和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一 片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01 M。（中性及弱硷性条件（PH7 -8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物 的形成，而高离子强度则有利于分解）9、拍照有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。 使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序；应 在暗室中进行检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每 次以12 h为宜，超过90 min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线 照射35 min后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬 灭现象；所以最多不得超过23 h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时 间，保