生化实验整理

1、氨基酸的分离鉴定一一纸层析法一、实验目的/ 了解层析技术的一般原理/掌握纸层析的方法和原理，学会分析未知样品的氨基酸成分二、实验原理层析法亦称色谱法，是利用混合物中各组分的物理、化学及生物学特性的 差异，使各组分以不同程度分布在两个相中，即固定相和流动相，当流动 相流过加有样品的固定相时，各组分所受固定相的阻滞作用和受流动相的 推动作用的影响各不相同，从而使各组分以不同速度移动而达到分离的目 的固定相：是由层析基质组成的，可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子 交换剂等），也可以是液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液），这些 基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用流动相：是在层

2、析过程中，推动固定相上待分离的物质向一定方向移动的 液体、气体或超临界体。柱层析中一般称为洗脱液，薄层层析时称为展层 剂分配系数：是指在一定的条件下，某一组分在固定相和流动相中含量（浓 度）的比例，常用K来表示，它是层析中分离纯化物质的重要依据迁移率：是指在一定条件下，某一组分在相同的时间内，在固定相移动的 距离与流动相本身移动的距离之比值，常用来表示分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先 决条件，差异越大，分离效果越理想层析根据不同的标准可以分为多种类型：如按固定相基质的形式不同可分 为纸层析、薄层层析和柱层析；按流动相的形式不同可分为液相层析、气 相层析和超临界层

3、析；按分离的原理不同可分为吸附层析、分配层析、凝 胶过滤层析、离子交换层析等纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的羟基具有亲水 性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持 物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。溶 质在滤纸上的移动速度吨值表示：Rf在一定条件下，某种物质的R值是常数。R值的大小与物质的结构、 性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关氨基酸显色反应茚三酮反应原理：妒所有的a-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物 质，除了脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质质 该反应分为两步：第一步是氨基酸被氧化形

4、成CO、NH和醛，水 合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮结合另 一分子水合茚三酮和氨缩合生成有色物质三、实验器材大试管及塞子，大头针，三角薄层喷瓶，毛细管，吹风机，层析滤纸（新华 一号），分液漏斗四、实验材料与试剂扩展剂：4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物氨基酸混合液：0.5%的赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸的混合液（各组份浓度均为0.5%） 显色剂：0.1%水合茚三铜正丁醇溶液五、实验操作取层析滤纸（20X2cm） 一条，在纸的一端距边缘3cm处用铅笔划一直线， 取其中点作为原点。在大试管中加入适当的扩展剂，使扩展剂的液面处于 悬挂在橡皮塞上的层析滤纸的原点到底端的中间点样

5、：用毛细管将氨基酸混合液点在原点上，用吹风机吹干，干后再点一 次。每次在纸上扩散的直径最大不超过3mm扩展：将点好样的层析滤纸悬挂于橡皮塞的钩子上，点样端的底边浸入扩 展剂约1.5cm。保持大试管的垂直，待溶剂上升1520cm时取出滤纸， 用铅笔描出溶剂前沿界限，用吹风机热风吹干显色：用三角薄层喷瓶将0.1%茚三酮正丁醇溶液均匀地喷在风干的层析 滤纸条上，用热风吹干即可显出各层析斑点计算各种氨基酸的Rf值六、注意事项为了防止滤纸被手上的汗液污染，应尽量在操作时带手套重复点样时可用吹风机的冷风吹干样品，喷了茚三酮后的显色则要用热风 吹干滤纸血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳一、实验目的 了解电泳技术的一

6、般原理学习醋酸纤维薄膜电泳的操作二、实验原理电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一 定pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷， 因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁 移率不同，因此可使它们分离影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度 和电渗现象影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状按支持介质不同可将电泳分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电 泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳另外，还可以按分离原理不同、支持介质形状不同、用途不同以及所用电 压不同等将电泳分类电泳的装置主要包括两个

7、部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳 槽中产生电场，驱动带电分子的迁移；电泳槽可以分为水平式和垂直式两 类采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸 纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为 醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120um,有 很强的通透性，对分子移动阻力很小醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技术，它具有微量、快速、简 便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋 白、a-球蛋白、B

8、-球蛋白、y-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由 于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。 以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染 色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为al-、 a2-、B-及Y-球蛋白三、实验器材醋酸纤维薄膜（2X8 cm），常压电泳仪，点样器（盖玻片），培养皿，粗 滤，载玻片，镊子四、实验材料与试剂兔血清（实验室制备），巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07），染色液（氨基黑10B），漂洗液五、实验操作浸泡：将2X8cm醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。在无光泽 面距短边一端1.5 cm处用

9、铅笔轻轻画一条点样线，将之置于盛有缓冲液 的平皿中，浸泡30 min方可用于点样点样：用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然 后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）。在另一载玻片上滴一滴血清，点样 器（用盖玻片的一边）在血清上蘸一下（可来回移动一次），再将点样器 轻印在加样线上，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线电泳槽的准备：根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在两 个电极槽中，各倒入等体积的电泳缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各 放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电泳缓冲 液中。当滤纸全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气 泡，使滤

10、纸的一端能紧贴在膜支架上，即为滤纸桥电泳：将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下）， 另一端平贴在阳极端支架上。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10 min。通电， 调节电压至160 V，电流强度为0.40.6 mA/cm膜宽度，电泳时间约25 min染色：电泳完毕后将薄膜取下，放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡 5 min漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱 尽，条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱六、注意事项市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。若飘浮于液面的薄膜在1530 s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一 致，则此

11、膜均匀可用于电泳醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥一巴比妥钠缓冲液，其浓度为 0.050.09mol/L。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度 过低，则区带泳动速度快区带扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速 度慢，区带分布过于集中，不易分辨点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但 不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响分离 效果点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电 泳区带分离效果电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.40.6mA/cm膜宽度。 电流强度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且

12、易扩散操作过程为防止指纹污染，应戴手套七、实验思考用醋酸纤维薄膜电泳做电泳支持物有什么优点？电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？蛋白质的透析一、实验目的 了解透析技术的一般原理。通过蛋白质透析实验掌握透析操作。二、实验原理透析是膜技术的一种，利用透析膜可以选择性的透过一定大小分子，从而 将待分离纯化的物质和杂质离子分离开。常见的透析有：蛋白质的透析和糖类的透析。透析是利用半透膜进行的一种选择性扩散操作，通常是将半透膜制成袋 状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样 品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断 扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度

13、达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液 称为“渗出液”或“透析液”。把需要透析的样品盛于透析袋内，袋内留有挤去空气的空余部分，以防由 于溶剂渗入造成样品体积增加而引起透析袋胀破。为了获得较快的透析速度，常常采取一些措施保持膜两侧浓度差具有最大 差，如经常更换透析外液，连续搅动外液。透析外液尽量不用纯水，常使用一定pH的低盐缓冲液，这样可以避免袋 内样品pH的变化和过分地稀释。透析袋出厂时都用10%的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属 和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用 前必须除去。透析袋的处理：一般是将透析袋剪成102

14、0cm的小段，在2%(W/V)NaHCO3和1mmol/L的EDTA (pH8.0)中煮沸10min，用蒸馏水彻底洗 尽透析袋，然后放在1mmol/L的EDTA (pH8.0)中煮沸10min，用蒸馏 水彻底洗尽透析袋，冷却后，存放于4C,从此时起取用透析袋，必须戴 手套。检查透析效果的方法：用1% BaCl2检查(NH4)2SO4，用1%AgNO3检查 NaCl、KCl 等。三、仪器、材料和试剂磁力搅拌器(配搅拌子)试管及试管架透析袋(截留分子量10000)蛋白质氯化钠溶液3个除去卵黄的鸡蛋清与700mL水及300mL饱和氯化钠溶液混合后，用 数层干纱布过滤。10%硝酸溶液1%硝酸银溶液1%

15、硫酸铜溶液10%氢氧化钠溶液四、操作步骤取1015mL蛋白质氯化钠溶液，装入处理好的透析袋中，夹紧两端，浸 入蒸馏水烧杯中进行12h的透析。用硝酸银检测烧杯中透析液是否有氯离子存在？ 12mL透析液+数滴10%硝酸溶液至酸性+ 1%硝酸银溶液用双缩脲法检测是否有蛋白质存在？蛋白质溶液在碱性环境下与铜离子反应生成紫红色化合物透析完全后，检测透析袋内是否存在蛋白质和氯离子?注意：透析完全时，透析袋内会出现球蛋白沉淀，因为球蛋白不溶于纯水。五、思考题透析的一般原理是什么？蛋白质透析的用途有哪些？蛋白质的性质实验(一)一一蛋白质及氨基酸的呈色反应一、实验目的了解蛋白质的基本结构单位及主要连接方式了解蛋

16、白质和某些氨基酸的呈色反应原理学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法二、实验原理双缩脲反应A两分子尿素加热到180C左右时，生成双缩月尿并放出一分子氮，双缩月尿在 碱性环境中能与CU2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应，因此该反 应可用于蛋白质的定性或定量测定茚三酮反应所有的a-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质，除了 脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质该反应十分灵敏，是一种常用的氨基酸定量测定方法该反应分为两步：第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三 酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原

17、型茚三酮结合另一分子 水合茚三酮和氨缩合生成有色物质黄色反应（Pauly反应）含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色 物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醍酸钠多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝 化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应考马斯亮蓝反应考马斯亮蓝G-250具有红色和蓝色两种色调，在酸性溶液中其以游离态存 在，呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色考马斯亮蓝G-250染色灵敏度比氨基黑高3倍，反应速度快，约在2min 左右时间内达到平衡，室温1h内保持稳定在0.011.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A595nm值

18、成正比，所以常用 来测定蛋白质的含量三、实验器材试管及试管架，试管夹，酒精灯，滴管，电炉，滤纸四、实验材料与试剂 尿素，10%NaOH溶液，1%CuSO4溶液，2%卵清蛋白溶液，0.5%甘 氨酸溶液，0.1 %茚三酮水溶液，0.1 %茚三酮乙醇溶液，鸡蛋清溶液，头 发，指甲，0.5%苯酚溶液，浓硝酸，0.3%色氨酸溶液，0.3%酪氨酸溶液， 考马斯亮蓝G-250溶液五、实验操作双缩脲反应取少量尿素结晶，放入干燥的试管，微火加热使尿素熔化，熔化的尿素开 始硬化时停止加热，尿素放出氮，形成双缩服冷却后，加入1mL 10%NaOH溶液，振荡混匀，再加入1滴1%CuSO4 溶液，振荡，观察实验现象向另

19、一支试管中加入约1mL 2%卵清蛋白溶液和约2mL 10%NaOH溶液， 摇匀，再加入2滴1%CuSO4溶液，随加随摇，观察实验现象茚三酮反应取2支试管，分别加入2%卵清蛋白溶液和0.5%甘氨酸溶液各1mL，再 各加0.5mL0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热12min，观察 实验现象在一块小滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，在原处滴一滴0.1%茚 三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察实验现象黄色反应（Pauly反应）取6支试管，按下表加入各试剂：管号123456材料鸡蛋清溶液 1滴指甲少许头发少许口.5奶苯酚 溶液4滴0.3%氨酸 溶液4滴0.3%酪氨 酸溶液4滴浓硝酸2滴5滴

20、5滴4滴4滴4滴现象观察各管的现象，若反应较慢，可略微放置或用微火加热待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%NaOH溶液至碱性，观察颜 色变化考马斯亮蓝反应取2支试管，按下表加入各试剂：管号、鸿蛋清溶液（mL）蒸徭水（mL）善马斯亮蓝染色液（tnL）101520.10.95观察实验现象，并解释六、实验思考通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法？它们的原理是什 么？蛋白质的性质实验（二）一一蛋白质的等电点测定和沉淀反应一、实验目的/ 了解蛋白质的两性解离性质/学习测定蛋白质等电点的一种方法/加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识/ 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义/ 了解蛋白质变性与沉

21、淀的关系二、实验原理蛋白质等电点测定蛋白质是两性电解质，在蛋白质溶液中存在下列平衡：RCHCO0HI也IHCHCOOH RCHCOORCHCOOMH；押 H；阳离子氨基酸的兼性离子明高子pH pl蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达 到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既 不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等 电点（PI）。不同蛋白质各有其特异的等电点，在等电点时，蛋白质的理化性质都有变 化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。我们测等电点最常 用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值本实验借观察酪蛋白在不

22、同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。 用醋酸与醋酸钠配制成各种不同pH值的缓冲液，向各缓冲液中加入酪蛋 白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点蛋白质的沉淀与变性在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲 水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水 而沉淀蛋白质的沉淀可分为两类：（1）可逆的沉淀反应：蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉 淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而 不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用 于蛋白质（2）不可逆的沉淀反应：蛋白质分子内部结构发生重

23、大改变，蛋白质常变 性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。如加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质 与重金属离子或某些有机酸的反应注意：蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷）， 并不析出，因此变性的蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也 未必都已变性沉淀蛋白质的方法盐析法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（如硫酸铵，硫酸钠或氯化钠）， 使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。 如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中 析出。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性，当除去盐后，即可溶解重金属盐沉淀法：当溶液pH大于蛋白质等电点时，蛋白质颗粒带负电荷， 容易与重金属离子（Hg2+、Pb2+、CU2+或Ag+）结合成不溶性盐而沉淀。误服 重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救就是因为它能 和重金属离子形成不溶性盐，然后再用催吐剂排出体外。某些有机酸沉淀法：某些有机酸指的是三氯乙酸、磺基水杨酸和硝酸等。 当溶液pH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与酸类的酸根负离 子发生反应生成不溶性盐而沉淀。有机溶剂沉淀法：向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂（甲醇、乙 醇或丙酮），