混合系列蛋白激酶样结构域MLKL通过磷酸化RIP引发坏死性的膜破裂

1、混合系列蛋白激酶样结构域MLKL被RIP3磷酸化可引发(yn f)坏死性的膜破裂 Huayi Wang,1 Liming Sun,1 Lijing Su,2 Josep Rizo,2 Lei Liu,1 Li-Feng Wang,3 Fu-Sheng Wang,3 and Xiaodong Wang1 王华翌、孙丽明、Lijing Su、Josep Rizo、刘磊、王立峰、王福生（北京(bi jn)302医院）、王晓东（Molecular Cell，2014）汇报人：付玮玮共三十六页一、前言(qin yn)程序性细胞死亡在多细胞个体的成长发育过程中扮有重要作用，主要分为两种途径凋亡和坏死，它们

2、有着不同的形态学和生物化学变化。凋亡主要表现为细胞体积缩小、核膜破裂、DNA降解为约180-200bp的整数倍、并最终形成胞膜包被的凋亡小体，很快被巨噬细胞和邻近细胞所吞噬。这些凋亡过程中形态学和生物化学的变化主要由一类半胱氨酸蛋白酶caspases执行。这些蛋白酶通过外在的死亡诱导信号激活，如肿瘤坏死因子受体或Bcl-2家族蛋白，它们可使原来位于线粒体膜间隙的蛋白质释放到胞浆，其中一种释放细胞色素(s s)C，与胞浆中的Apaf-1结合后激活caspases。共三十六页肿瘤坏死因子（TNF）还可诱导细胞坏死，表现为细胞肿胀、胞内细胞器变形或肿大、细胞ATP含量减少、细胞膜破裂。这种形式的坏死

3、,又称为necroptosis，需要受体互作的蛋白激酶RIP1、RIP3的激活。研究采用RIP3敲除的小鼠证实这种形式的细胞死亡对于应答微生物感染和炎症介导的组织损伤具有重要(zhngyo)意义。RIP3如何引发细胞坏死以及该途径是否自然运行在人类组织中是我们理解细胞坏死面临的两大难题。RIP1, RIP3以及MLKL相互结合形成一个信号复合体，被称作“necrosome”。 且MLKL激酶结构域的357位的苏氨酸和358位的丝氨酸（人源）在细胞程序性坏死被启动后被RIP3磷酸化。MLKL是拥有激酶结构域（与RIP3结合）但无激酶功能的假激酶。MLKL敲除的小鼠被证实与RIP3敲除的小鼠对细胞

4、坏死具有相似的抵抗能力。但MLKL磷酸化导致细胞坏死的机制目前尚不清楚。共三十六页在当前研究中，我们开发了特异性检测人类MLKL蛋白在细胞坏死途径中第357位苏氨酸和358位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体(kngt)。通过一系列的生化试验，我们发现necrosome从胞浆向质膜和细胞器膜上转位，这种转变使MLKL在磷酸化驱使的聚合后获得与脂质直接结合的能力。一旦这些变化发生在膜上，聚合的MLKL将形成膜通透性孔道，破坏膜的完整性，引起细胞坏死。共三十六页二、文章(wnzhng)的总体模式图 RIP1, RIP3以及MLKL相互结合形成一个细胞坏死复合体 “necrosome”；MLKL激酶结构域的T

5、357/S358位被RIP3磷酸化；磷酸化的MLKL从单体状态向寡聚体状态转化；寡聚化的MLKL结合磷酸肌醇和心肌磷脂(ln zh),整个复合体从细胞质转移到细胞膜和细胞器膜上，并在这些膜结构上形成通透性孔道，破坏膜的完整性，引起细胞坏死。共三十六页三、文章(wnzhng)的亮点RIP3 激酶对MLKL T357/S358 位的磷酸化驱使MLKL形成寡聚物；MLKL 寡聚物从胞浆易位到 细胞器膜和质膜上；MLKL 寡聚物在细胞坏死过程(guchng)中直接破坏细胞膜的完整性；MLKL 磷酸化发生在药物引起的肝损伤病人活检组织中。共三十六页1. MLKL磷酸化是细胞坏死的标志；2. 磷酸化的ML

6、KL在细胞坏死过程中易位到膜部分；3. Necrosomes复合体在细胞坏死过程中转移到质膜和细胞器膜上；4. MLKL在细胞坏死过程中形成寡聚体；5. MLKL结合磷脂和脂质体；6. MLKL通过在膜上形成通透性孔道引起(ynq)膜泄漏和细胞坏死；7.药物引起的肝损伤病人活检组织中检测到MLKL磷酸化信号。四、文章结构框架(kun ji)流程图(主要通过7幅图展开)共三十六页图1、MLKL磷酸化是细胞(xbo)坏死的标志 共三十六页图A：采用MLKL磷酸特异性抗体检测MLKL在细胞坏死过程中的磷酸化情况（HT-29细胞处理8h）；1-7孔道为细胞坏死诱导物，D：二甲基亚砜；T：TNF-；S：

7、Smac 类似物；Z：Z-VAD-fmk；文献表明 Smac 类似物可以刺激(cj)细胞自分泌TNF-。下图为HT-29细胞采用不同的细胞坏死诱导物处理(chl)12h后的细胞存活率；使用的为 CellTiter-Glo kit试剂盒，ATP是活细胞新陈代谢的一个指标，通过对ATP定量测定可以检测培养物中的活细胞数目；磷酸化的MLKL与细胞死亡具有一定的相关性。共三十六页图B 进一步验证了MLKL磷酸化与细胞死亡相关(xinggun)；从图可以看出HT-29细胞在TSZ共同处理下不同时间的p-MLKL、ATP水平和膜泄漏情况（通过测定胞质蛋白酶的活性得到，CytoTox-Glo kit）；6小

8、时后三个信号同时出现变化。共三十六页图C-D：细胞(xbo)坏死抑制剂对MLKL磷酸化的不同影响；（Nec-1：RIP1抑制剂；NSA：MLKL抑制剂）；磷酸化的MLKL信号可以被Nec-1阻止，但不能被NSA阻止，表明MLKL在细胞坏死中功能位于RIP1/RIP3的下游；图E：Knocking down RIP3的表达可以阻止MLKL的磷酸化；敲除任一蛋白均可阻止细胞坏死或减弱MLKL磷酸化信号（4、6道），但敲除MLKL不能阻止RIP3对其的磷酸化（2、6道）；共三十六页 补充图中又对另一种人类(rnli)细胞系（白血病细胞株U937）进行了类似的研究，发现MLKL磷酸化信号和细胞坏死的相

9、关性同样出现在U937细胞系中。共三十六页图2、磷酸化的MLKL在细胞坏死(hui s)过程中易位到膜部分 共三十六页图2A：采用Trion X-114分离内在膜蛋白的示意图；图2B：HT-29在TSZ处理的不同时间点细胞(xbo)提取物的western blotting情况；细胞坏死诱导6小时后，磷酸化的MLKL在水相出现，且非磷酸化的MLKL逐渐减少；同时，磷酸化的MLKL此时出现在膜相；暗示MLKL在被RIP3磷酸化后从溶胶转移到膜部分。共三十六页图2C：NSA（MLKL抑制剂）先前验证出不能阻止MLKL发生磷酸化，但可以阻止细胞坏死，现在验证NSA可以阻止p-MLKL转移到膜上；分别对

10、比2、6和4、8，在没加坏死抑制剂时，p-MLKL主要集中在膜上，加抑制剂后，则主要在水相，暗示NSA虽然不影响MLKL的磷酸化，但p-MLKL不转移到膜上；图2D：MLKL磷酸化位点突变后在细胞坏死过程(guchng)中不会转移到膜上。共三十六页图3、Necrosomes复合体在细胞坏死(hui s)过程中转移到质膜和细胞器膜上共三十六页 图3A：差速离心分离细胞器的基本步骤；图3B：细胞器特异性标记（质膜和核内体：EGFR；线粒体：Tom20；溶酶体和核内体: Lamp1 ；内质网：ERp72）；左图显示仅用TNF处理，不出现p-MLKL，且MLKL、RIP3、RIP1主要存在(cnzi)

11、于S100，即上清液水相中；RIP1在水相和膜上都比较多，暗示其可结合TNF受体。右图显示在TSZ处理后，p-MLKL出现在各种细胞器膜上。共三十六页图3C： 前三行红色点和绿色(l s)点的重叠百分比为14%-23%；细胞膜的p-MLKL信号为22%。线粒体内质网的正常驻留(zh li)蛋白溶酶体和核内体微分干涉图像质膜共三十六页 补充(bchng)图共三十六页图4、MLKL在细胞坏死(hui s)过程中形成寡聚体共三十六页 图4A：P-MLKL在非还原凝胶中有寡聚体存在，在还原凝胶则没有；寡聚体靠二硫键连接；图4B：采用凝胶过滤（Superdex 200）分析纯化的重组蛋白MLKL；洗脱位

12、置表明了分子大小(dxio)（见标尺，甲状腺球蛋白,670 kDa;铁蛋白,440 kDa;BSA,67 kDa;卵清蛋白,44 kDa;核糖核酸酶A,14 kDa）；非还原(hun yun)凝胶还原凝胶共三十六页图4C：使用化学交联剂检测MLKL蛋白的自组装；左边不含交联剂的MLKL蛋白全为单体；右边加入交联剂后蛋白出现(chxin)寡聚体；但357A/358A突变不能磷酸化故而仍为单体；图4D：MLKL磷酸化对于细胞坏死过程中寡聚体的形成是必须的（非还原状态）；左边正常型可以发生磷酸化，因此既有单体又有寡聚体，右边突变后不能磷酸化因而只有单体形式；共三十六页图5、MLKL结合(jih)磷脂

13、和脂质体 共三十六页 图5A：（TAG：甘油三酯；DAG：甘油二酯；PA：磷脂酸；PS：磷酯酰丝氨酸；PE：磷脂酰乙醇胺；PC：卵磷脂；PG：磷脂酰甘油；Cardiolipin:心磷脂；PI：磷脂酰肌醇；Cholesterol：胆固醇）；15种膜脂的布局图；图5B：MLKL-FL(full-length，1471 aa); MLKL-CC(coiled-coil domain,1178 aa); MLKL-KL( kinase-like domain，179471 aa)；使用Anti-N-terminal or C-terminal MLKL antibodies 检测 MLKL signa

14、l。4种磷脂-心磷脂、PI4P、PI(4,5)P2、PI(3,4,5)P3结合(jih)最多；KL结构域不结合任何脂质。共三十六页图5C：MLKL结合包含磷脂的脂质体；S：上清；P：沉淀物；只有PI(4)P和PI(4,5)P2招募到了MLKL蛋白，且PI(4,5)P2对MLKL有更高的亲和力；绝大多数的MLKL蛋白与包含15%心磷脂的脂质体（与线粒体水平接近）结合，而只有少量蛋白与包含5%心磷脂的脂质体结合；图5D：通过比较(bjio)正常型和突变型MLKL蛋白对脂质体亲和力的区别，进一步验证MLKL对脂质体结合的特异性。共三十六页图6、MLKL通过(tnggu)在膜上形成通透性孔道引起膜泄漏

15、和细胞坏死共三十六页图6A-C：先让Tb3+离子和脂质体结合，然后和带有DPA的MLKL蛋白孵育，Tb3+有弱荧光活性，当从脂质体中释放与DPA结合时，Tb3+/DPA螯合物使荧光活性增加104倍，从而给出脂质体破裂的信号；图6A为三种形式的MLKL蛋白膜破裂情况(qngkung)；图6B为脂质体中包含不同脂类时膜破裂的情况；图6C为添加NSA后可以抑制膜的破裂；共三十六页图6D：MLKL全长或N端卷曲结构域可以使膜破裂；而C端激酶结构域不起作用；图6E：采用人类骨肉瘤细胞系U2OS，其中MLKL-FKBPV融合蛋白受doxycycline（多西环素）诱导的启动子控制，U2OS不表达RIP3，

16、因此正常情况下不经历(jngl)细胞坏死；仅当Dox存在时可表达融合蛋白，但有30%的细胞死亡，添加AP20187后，细胞死亡率增加到60%；添加z-VAD和Nec-1时没有显著变化，但添加NSA时细胞死亡率下降，暗示细胞死亡是由MLKL介导的。共三十六页图6F：U2OS在Dox诱导且AP20187处理后细胞坏死情况；SYTOX专染死细胞，它能轻松透过质膜受损的细胞，但不能穿过(chun u)活细胞膜，用绿光区别。共三十六页图7、药物引起(ynq)的肝损伤病人活检组织中检测到MLKL磷酸化信号共三十六页图7A：药物引起的肝损伤病人活检组织染色（图中显示病变部位三个临近的区域）；a为苏木(s m

17、)精将细胞核染成蓝紫色，phospho-MLKL抗体将病变部位复染为红色；b为没有采用第一抗体染色的阴性对照；c为苏木精和phospho-MLKL抗体复染的肝损伤严重的部位；共三十六页图7B：两个健康器官移植捐赠者的肝活检组织(zzh)样本的免疫组织(zzh)化学染色；共三十六页图7C-D：药物引起(ynq)的肝损伤病人活检组织在高倍显微镜下的染色情况； phospho-MLKL染色位于肝细胞内，且出现在细胞坏死的不同阶段；阳性细胞呈现棕色，白色箭头所指的炎症细胞浸润受伤区域，随之发生细胞坏死。共三十六页图7D-E：13个健康人和14个病人phospho-MLKL信号(xnho)的差异；两种方法均显示phospho-MLKL阳性染色与该疾病有显著相关；共三十六页Thank you共三十六页内容摘要混合系列蛋白激酶样结构域MLKL被RIP3磷酸化可引发