淋病的实验室诊断教学课件

1、淋病的实验室诊断概况 淋病（gonorrhea）是指由淋病奈瑟氏菌引起的泌尿生殖器化脓性感染,是法定的乙类传染病主要引起的疾病有：尿道炎、宫颈炎。泌尿生殖器其它部位：附睾炎、前列腺炎、输卵管炎和盆腔炎等全身其它部位（播散性淋病）：淋球菌性关节炎、腱鞘炎、心内膜炎和脑膜炎等合并症。淋菌性咽炎、淋菌性直肠炎和淋球性眼炎、淋菌性皮炎5%-20%的男性和60%女性病人没有临床症状。理化特性淋球菌对外界理化因子抵抗力比较弱,不耐干燥,不耐冷和热，对普通化学消毒剂较敏感普通家用洗衣粉对淋球菌具有较强抑杀作用,此主要是洗衣粉中含有表面活性剂、磷酸盐及其他去垢剂均对细菌有杀灭或抑制作用杀灭和清除该菌的污染,切

2、断传播途径并不困难。普通洗衣粉浸泡洗涤,太阳下晾晒,热水煮均具有良好的消毒效果,可以用这些方法预防淋球菌感染,切断间接传播途径 临床特征患者以中青年为主。性接触为主要的传播途径。男女易感。生殖器感染多见。儿童可通过污染了淋球菌的物品间接感染,新生儿可通过母亲产道分泌物间接感染 传染特性成人以直接性接触为主，儿童和新生儿间接传染；男性患有淋病，传给女性的机率为70%；女性患有淋病，传给男性的机率为30%；没有终生免疫力。实验室检查方法直接显微镜检查革兰阴性双球菌；分离培养淋球菌；非培养技术检测淋球菌细胞成份如抗原或DNA（EIA, PCR/LCR） 临床检验标本取材部位（）男性异性恋者:采集尿道

3、标本，有口淫史者加取咽部标本；同性恋者: 采集尿道、直肠及咽部标本.女性 采集宫颈标本，必要时从尿道、直肠、咽部、前庭大腺和尿道旁腺取材.临床检验标本取材部位（）幼女 幼女和/或处女膜未破的感染者标本：采集阴道分泌物新生儿眼炎患者 采集眼结膜分泌物标本采集注意事项结果影响因素：取材方法不妥当，直接影响检测结果。细胞特性：淋球菌主要侵犯柱状上皮和移行上皮细胞。采集时间和深度：嘱病人早晨起床不小便检查或者排尿后23小时取材。男性尿道口24cm，女性宫颈口1.5cm。淋球菌培养时，应采无菌采取标本。 直接显微镜检查男性标本的采取淋球菌感染的男性病人，会出现尿痛和尿道流脓等症状，采样前用灭菌等渗盐水拭

4、子揩洗尿道口，然后用手指由后向前挤出脓液，蘸取脓液后轻轻涂布于载玻片上（涂片厚薄要合适）。直接显微镜检查女性标本采取避免重复采样停止阴道内塞药，减少干扰因素。不要用润滑油。宫颈外口的清洁。标本采集成功的标志：镜下可见鳞状上皮和柱状上皮。幼女标本的采集：阴道采样。固定标本自然干燥；火焰迅速通过23次；固定要及时；原因:防止菌体结构模糊，细胞变形扭曲 革兰氏染色方法初染：结晶紫染0.51分钟，水洗。媒染：碘液媒染1分钟，水洗。脱色：乙醇脱色0.51分钟，水洗。复染：复红染0.5分钟，水洗，晾干后镜检。 革兰氏染色结果革兰氏染色：革兰氏染色阴性（红色）。菌体形：卵圆形，接触面扁平或稍凹。大小：长0.

5、7um，宽0.5um。排列状况：一般成对排列，有时亦呈单个、四联、八叠状排列。排列位置：一般位于细胞浆内，病程长，可见于胞浆外。镜下还可见大量红色多形核白细胞。革兰染色：细胞内革兰阴性双球菌 美蓝染色美蓝 0.3g 95%乙醇 30mlH2O 至100ml1%KOH 0.1ml固定：染12分钟，水洗，镜检。美蓝染色结果：背景细胞和菌体呈兰色。美蓝染色的优点：清晰、省时。美兰染色 意义男性细胞内G-肾形双球，初步诊断淋病。敏感性和特导性：均达9599%。女性：宫颈分泌物杂菌多，敏感性低，不推荐用直接涂片法检查病人。报告方式细胞内外革兰阴性双球菌 淋球菌分离培养取材培养基培养条件结果临床意义。淋球

6、菌分离培养（取材）男性：尿道口24cm上，标本略带粘液；必要时取前列腺液，提高阳性率；女性:宫颈口1.5cm转动并停留1030秒。不使用润滑油湿润扩阴器。幼女：阴道分泌物。肛门：肛门2.5cm以上，碰到粪便应重取。咽：扁桃体及扁桃体窝。眼：眼分泌物。取材时，注意无菌操作，取材前应该停药一周。淋球菌分离培养基血琼脂或巧克力琼脂：810%脱纤维羊血、马血、兔血、人血T-M培养基 T-M培养基GC基础琼脂：3.6%.血红蛋白粉1%抗生素增菌剂PH：7.4抗生素的作用林可霉素代替万古霉素 淋球菌分离培养条件温度：3536OC湿度：一定的水份CO2：5%CO2对外环境影响：标本离体时间要短、保湿，必要时

7、用运送培养基，平皿接种前要预温淋球菌分离培养结果观察时间：2448小时，阴性结果最好72小时以后发报告。菌落外观：圆形、凸起、湿润、光滑、半透明或灰白色。菌落大小：0.51mm。粘性：有粘性。涂片观察：25%为典型的双球菌，75%为半球菌，四联或八叠。自溶：菌龄长，易自溶。淋球菌分离培养意义培养法为诊断淋病的金标准.对女性淋病的确诊应做淋球菌培养 从选择性培养基上分离出淋球菌即可诊断淋病。培养的敏感性81-100%。培养的优点有： 特异性极高（100%）； 可发现无症状淋球菌感染患者； 可用于进一步作药敏试验； 可用于治疗后的判愈试验。 初步鉴定菌落特征氧化酶试验过氧化氢酶试验革兰染色 氧化酶

8、试验原理：淋球菌在生长过程中产生氧化酶。往培养基上生长了24小时48小时的菌落上加氧化酶试剂，淋球菌菌落颜色可变成紫红乃至黑色。方法：试剂溶液和纸片。结果：变紫红。试剂配制：0.51%盐酸四甲基对苯二胺或盐酸二甲基对苯二胺。注意事项：试剂要置棕色瓶避光保存一周。纸片可保存一年。意义。 过氧化氢酶试验原理：淋球菌产生过氧化氢酶。该酶能使过氧化氢迅速分解成水和氧气，出现气泡。方法：将30%过氧化氢（V/V）溶液滴于可疑菌落表面，或从培养基上挑取一接种环菌落置于干净载玻片上，然后加一滴30%过氧化氢溶液。结果:1秒钟内产生大量气泡为阳性。意义：阴性排除淋球菌，98%脑膜炎球菌为阴性。确证鉴定糖发酵试

9、验免疫学试验 -荧光抗体染色 -协同凝集试验 酶底物试验DNA探针试验 糖发酵试验原理:分解葡萄糖、产酸，pH值降低，酚红由红变黄,溴甲酚紫由紫变黄。方法：传统的的试验仅作参照方法使用，实际工作中使用14小时读结果的改良法。结果:葡萄糖发酵，麦、乳、蔗糖不发酵。注意事项：糖要纯（特别是麦芽糖中含葡萄糖量要小于0.25%）。菌要新鲜（1824小时的淋球菌菌落）。快速非生长糖发酵微量法用无选择性的巧克力或哥伦比亚琼脂平皿（含5%马血或羊血）转种受检菌株，以获得纯菌。挑取培养18小时 24小时的纯菌2满环（直径3mm）混悬于0.3ml 0.4ml缓冲平衡盐指示溶液（BSS）中，制成浓浊菌悬液。每升B

10、SS中含磷酸氢二钾0.4g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钾8g，酚红0.6g，pH值为7.1 7.2。过滤灭菌后储存于4冰箱备用。用5支70mm10mm小试管，在1管 4管中分别加入20%经过滤灭菌的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖溶液各0.05ml。第5管不加糖（对照管）。每管加0.1ml BSS。每管加0.05ml菌悬液，充分混匀。在37水浴箱中卵育4小时，观察结果。淋球菌只发酵葡萄糖，不发酵其余的糖，葡萄糖管由红变黄。糖发酵试验-奈瑟球菌属的糖发酵特征细菌葡萄糖麦芽糖乳糖蔗糖淋球菌+-脑膜炎球菌+-乳酰胺奈瑟菌+-灰色奈瑟球菌-布兰汉卡他球菌-淋球菌的鉴定特征菌落形态淋球菌菌落形态革兰染色革兰阴性

11、双球菌氧化酶试验阳性过氧化物酶试验阳性快速糖发酵试验G+ L- M- S- 淋病实验室检查的其它方法白细胞脂酶快速法ELISA方法（抗原检测）：有症状的男性效果较好：阳性率93.3%，很少有假阳性。女性标本不理想：阳性率87%。可以尿液为标本。：不作为常规筛选的方法。ELISA法（抗体检测）抗体检出率低，50%左右，不能区分既往感染还是现症病人，交叉反应，女性抗体检出率高，亦没诊断价值。非培养诊断技术-核酸检测核酸检测的特点 不依赖于活的病原体的存在，无需特殊运送条件； 仅适合尿道或宫颈标本，以及尿液； 不能进行抗生素敏感性试验 用于判愈试验需在治疗后至少3 周以上进行. 淋球菌耐药检测方法纸

12、片扩散法琼脂稀释法E-test法分子生物学方法(耐药基因检测)纸片扩散法原理方法结果临床意义注意事项 纸片扩散法原理将含药纸片贴到涂有淋球菌的培养基上，药物即扩散到琼脂中。如果淋球菌对此药敏感，则生长被抑制，在纸片周围形成一个透明的抑菌圈。琼脂中药物浓度与纸片距离成反比，距纸片越远药物浓度越小。因而，可根据抑菌圈的大小判定细菌对该药的敏感、中介、耐药纸片扩散法方法菌种和纯化菌悬液的制备M-H肉汤1*109cfu/ml浓度菌液涂布贴纸片孵育条件：35OC，5%CO2，1618小时琼脂纸片扩散法琼脂纸片扩散法纸片扩散法临床意义最常用的方法操作简便影响因素多，结果不够稳定指导治疗不适合菌株系统的耐药

13、监测纸片扩散法注意事项每类药品选一种为代表菌悬液制备：一定1824小时菌苔贴纸片的时间：菌液涂布后放置35分钟，30分钟内一定要贴完药物纸片的贮存琼脂稀释法 ( 原理)将待检菌株种于含有不同抗菌药物的琼脂平皿上，药物浓度小时细菌生长，药物浓度高时细菌生长被抑制，据此可测出药物对该菌的最小抑菌浓度，依标准判定菌是否为耐药菌株方法抗生素贮存液 A 青霉素：精确秤取3.2mg青霉素，溶于1ml灭菌蒸馏水-3200g/ml，-70或-30冰箱贮存。 B 四环素：精确秤取3.2mg四环素，溶于1ml灭菌蒸馏水-3200g/ml，-70或-30冰箱贮存。 C 壮观霉素：精确秤取25.6mg壮观霉素，溶于1

14、ml灭菌蒸馏水-25600g/ml，-70或-30冰箱贮存。 D 头孢三嗪：精确秤取2mg头孢三嗪，溶于1ml灭菌蒸馏水-2000g/ml，-70或-30冰箱贮存。 E 环丙氟派酸：精确秤取3.2mg环丙氟派酸，溶于1ml灭菌蒸馏水-3200g/ml，-70或-30冰箱贮存。方法2抗生素工作液 从低温冰箱中取出抗生素贮存液，室温溶解，用灭菌蒸馏水作倍比稀释，从高浓度向低浓度。 A、青霉素：1600-800-400-200-100-50-25-12.5-6.25-3.12-1.56-0.78g/ml。 B、四环素：1600-800g/ml。 C、壮观霉素：25600-12800-6400-320

15、0-1600-800-400-200g/ml。 D、头孢三嗪：贮存液先作1：10稀释（2000UG/ML-200UG/ML），再作倍比稀释。100-50-25-12.5-6.25-3.12-1.56-0.78-0.4-0.2g/ml。E、环丙氟派酸：1600-800-400-200-100-50-25-12.5-6.25-3.12-1.56-0.78-0.4-0.2g/ml。方法3抗生素琼脂培养基 3.7% GC基础琼脂（Difco）+ 9%脱纤维羊血 + 适合浓度的抗生素。 先将琼脂高压灭菌，水浴冷却至50，加入无菌脱纤维羊血（终浓度9%）。取0.1ml倍比稀释好的抗生素工作液 + 10ml

16、 GC血液琼脂培养基（或0.2ml抗生素液 + 20ml培养基），混匀后倾倒平皿（7cm或9cm），从低浓度到高浓度配制。方法4接种物的制备及接种 取在37、5% CO2条件下在GC血液琼脂培养基上过夜生长的淋球菌菌苔，在0.03mol/l磷酸盐缓冲液（pH7.2）中制成每毫升含3108菌落形成单位的悬液。 用多关接种器吸取107菌悬液或用特制的白金耳挑取菌液（1 2l），接种到不含抗生素的对照平皿和含不同抗生素的培养基上（从低浓度平皿到高浓度平皿依次接种）。在37、5% CO2条件下培养。结果观察培养36 48小时后观察结果。观察阴性对照，以确保未含抗生素的平皿中淋球菌生长良好。 观察WHO

17、标准菌株的MIC是否在正常范围。在培养皿上淋球菌被完全抑制或薄雾状生长判为终点结果。淋球菌不生长的最高药物稀释度即为抗生素对淋球菌的最小抑菌浓度（MIC），常用g/ml表示琼脂稀释法E-test法原理稀释法和扩散法原理的结合产物。当Etest试条被放至一个已接种细菌的琼脂平板时，其载体上的抗生素迅即且有效地释放入琼脂介质，从而在试条下方马上建立了一个抗生素浓度的连续的指数梯度。结过孵育后，当细菌的生长清晰可辨时，即可见一个以试条为中心的对称抑菌椭园环。椭园环边缘与试条的交界处的刻度（以g/ml为单位）即为MIC值E-test法方法菌种纯化菌悬液的制备：1824小时的淋球菌菌落，生理盐水调成0.

18、5麦氏单位菌悬液的涂布：将菌悬液涂布于10%GC血液琼脂平板孵育：36OC，5%CO224小时读取结果：读取E-TEST试条，椭圆抑菌环边缘与刻度载体交界点上的数值为MIC值E test淋球菌耐药性定义定义缩略词标准产青霉素酶淋球菌PPNGB-内酰胺酶阳性四环素MIC16ug/ml质粒介导的耐四环素淋球菌TRNGB-内酰胺酶阴性四环素MIC16ug/ml产青霉素酶淋球菌/质粒介导的耐四环素淋球菌PPNG/TRNGB-内酰胺酶阳性四环素MIC16ug/ml染色体介导的耐青霉素和四环素淋球菌CMRNGPT非PPNG, 非TRNG青霉素和四环素MIC1ug/ml染色体介导的耐青霉素淋球菌CMRNGP

19、非PPNG, 非TRNG青霉素MIC1ug/ml淋球菌耐药性定义定义缩略词标准染色体介导的耐四环素淋球菌CMRNGT非PPNG, 非TRNG四环素MIC1ug/ml染色体介导的耐喹诺酮淋球菌QRNG环丙沙星MIC0.5ug/ml染色体介导的耐环丙沙星淋球菌CRNG环丙沙星MIC1ug/ml染色体介导的耐大观霉素淋球菌大观霉素MIC 128ug/ml耐cefozopran淋球菌 CZRNG cefozopran MIC8-16 ug/ml年份 菌株 青霉素 头孢曲松 (年) (株) S I R MIC50 MIC90 S MIC50 MIC90 1998 124 0.8 39.5 59.7 2

20、4 53.2 46.8 0.0312 0.125 1999 167 1.7 33.5 65.3 2 8 91.6 8.4 0.0156 0.0312 2000 100 5 52 43 1 16 57 43 0.0312 0.0625 2001 112 0 46.4 53.6 1 8 77.7 22.3 0.0156 0.0625 2002 100 42 58 0.0312 0.0625 2003 116 62.9 37.1 0.0312 0.125 2004 127 10.2 89.8 4 32 55.1 44.9 0.0312 0.1252005 110 6.4 93.6 4 32 42.7 57.3 0.0625 0.125956株淋球菌对种抗生素的药敏结果 956株淋球菌对种抗生素的药敏结果年份 菌株 壮观霉素 环丙沙星 TRNG PPNG(年) (株) S I MIC50 MIC90 S I R MIC50 MIC90 1998 124 99.2