巴斯德毕赤酵母表达系统教学课件

1、巴斯德毕赤酵母表达系统报告人：彭平平第1页，共20页。第2页，共20页。起源及背景巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是8O年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。30年前Koichi Ogata首次发现有些酵母可以利用甲醇为唯一的碳源和能源.70年代Philips pertoleum公司就开发出高密度连续发酵生产毕赤酵母的工艺(细胞干重130g/L)。第3页，共20页。80年代由Philips pertoleum公司合作开发毕赤酵母表达外源基因的研究。研究人员分离了醇氧化酶（AOX）的基因和启动子，构建了载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作的相关技术。1993年Phili

2、ps pertoleum公司委托Invrtigone公司代理毕赤酵母表达系统的产品。第4页，共20页。 毕赤酵母与其它表达系统相比 有许多优点1、毕赤酵母是需氧酵母菌，在有氧条件下能高密度生长，因此有利于扩大生产获得高浓度细胞，从而进行高效表达2、通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构稳定，不易丢失；且外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，能够筛选到高表达菌株3、毕赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)基因的强启动子特别适用于外源基因的调控表达 第5页，共20页。4、毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分 泌性的外源蛋白容易从培养基的基质中分离5、毕赤酵母对外

3、源蛋白产物进行N一乙酰糖基化修饰的结构为高甘露糖型，糖链平均为814个甘露糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含 1，3连接的甘露糖残基(有强的免疫原性)，因而适用于临床应用6、使用方便、简单，而且成本较低第6页，共20页。第7页，共20页。第8页，共20页。醇氧化酶（AOX） 甲醇 AOX 甲醛 H2O2 微体 细胞 第9页，共20页。毕赤酵母质粒载体第10页，共20页。几个概念同源基因重组 ：同源染 色体的非姐妹染色单体的 交叉互换引起的互换重组穿梭质粒：是指人工构建的 具有两种不同复制起点和选 择标记，可在两种不同类群 宿主中存活和复制的质粒载体。第11页，共20页。pPIC9k质粒图谱

4、AOX-醇氧化酶 S - 分泌信号MCS 多克隆位点TT-终止信号HIS4-组氨醇脱氢酶Kanamycin-抗卡拉霉素基因pBR322-大肠杆菌的复制起始位点Ampicillin-抗氨苄青霉素基因第12页，共20页。外源蛋白的引入表达第13页，共20页。菌株类型第14页，共20页。Mut表型与甲醇利用率Mut5AOX基因3AOX基因表型Mut+存在存在正表型Muts缺失存在缓慢型Mut-缺失缺失负型第15页，共20页。选择过程 HIS4缺陷培养基 G418酵母培养基 低 高G418：是一种氨基糖苷类抗生素，Kanamycin抗性 基因能对抗G418对酵母的毒性导入质粒第16页，共20页。发酵过程一般分为三个阶段：成长期，该阶段以甘油为碳源，主要目的是收获一定的菌量，该阶段一般采取分批补料的方式进行；过渡期，随成长期的结束酵母即进入过渡期，该期不加碳源，目的是消耗掉甘油，解除对AOX1启动子阻遏；诱导期，即当甘油被消耗尽，过渡期结束时，在发酵液中流加甲醇诱导重组蛋白的表达。 第17页，共20页。 应用举例依森泰德（Exenatide）是首个合成肠促胰岛素类似物，具有多种降血糖作用。HAS：人血清白蛋白ExenatideTwice a day2.4h被代谢ExenatideHSAPC