蛋白质芯片研究进展课件

1、蛋白质芯片研究进展高 雁指导老师：林炳承 研究员Seminar I第1页，共21页。内容提要蛋白质芯片概述蛋白质芯片的关键技术蛋白质芯片的应用展望第2页，共21页。蛋白质芯片的定义生物芯片基因芯片蛋白质芯片微流控芯片蛋白质芯片, 又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。 / Markus F, et al., DDT, 2002, 7,815-822.Bertone P,et al.

2、, FEBS Journal, 2005, 272 , 54005411.第3页，共21页。研究蛋白质芯片的意义蛋白质是基因表达的最终产物, 接近生命活动的物质层面； 探针蛋白特异性高、亲和力强, 可简化样品前处理，甚至可直接利用生物材料(血样、尿样、细胞及组织等)进行检测；适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物；有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用。第4页，共21页。蛋白质检测芯片蛋白质功能芯片 蛋白质芯片的分类Poetz O et. al, Mechanisms of geing and Development, 2005, 126 ,161170.第5页，共21页。蛋白质芯片的关

3、键技术提出生物学问题（实验目的）样品预处理（重组蛋白，制备一、二级抗体，荧光标记，配蛋白印记缓冲液）生化反应化学偶合，加底物，反应温度和时间，冲洗条件检测（荧光和比色扫描或拍照，参数设置）数据分析和建模（图象量化，标准化，采集蛋白信息，建立模型）12345蛋白质芯片制备6Schena M, Protein microarrays,2005, 7.第6页，共21页。蛋白质芯片的制备固相载体及其处理 载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片） 蛋白质的预处理 选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解点制微阵列 可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等固定微阵列上的蛋白样点 膜为载体：芯片放入湿盒，

4、 37C 1h 载玻片为载体：化学修饰产生醛 基固定蛋白微阵列的封闭主要封闭试剂：BSA或Gly李瑶，基因芯片与功能基因组，2004，32-33.第7页，共21页。蛋白质芯片比较 表面 蛋白固定方式 优点 缺点 PVDF 吸附 无需蛋白修饰过程，高结合容量 非特异吸附，分布随机Nitrocellulose 吸附 无需蛋白修饰过程，高结合容量 非特异吸附，高背景，低密度 无需蛋白修饰过程，高密度， 非特异吸附，分布随机 高分辨检测Epoxy-activated 高密度，高分辨检测 分布随机，表面有吸附PDMS nanowell 高密度，适合复杂的生化分析 Gold coated silicon

5、高密度，低背景，易与SPR或MS 联用 分布随机，制作难，未商品化Avidin coated 亲和结合 蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需生物素化 Ni-NTA coated 亲和结合 蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需His x6标记 表面蛋白分布均一容量Agarose thin film 制作难，未商品化3D gel pad吸附，共价偶联Poly-lysine coatedAldehyde-coated共价偶联扩散 无需蛋白修饰过程，高结合容量 Zhu H et.al, Current Opinion in chemical Biology,2003,7,55-63.第

6、8页，共21页。蛋白质芯片检测探针标记检测法无探针标记检测法表面增强激光解吸离子化技术(Surface enhanced laser desorption/ionization, SELDI)表面等离子体共振检测技术（surface plasmon resonance, SPR）原子力显微镜检测技术（atomic force microscope, AFM ）同位素标记检测荧光标记检测化学发光检测酶免疫标记检测胶体金标记检测第9页，共21页。蛋白质芯片的应用疾病诊断和预警药物开发 蛋白质组学 第10页，共21页。定量检测组织提取液中的肿瘤标记物Weissenstein U, Proteomic

7、s 2006, 6, 14271436.孵育后的微阵列荧光图 A 含抗原 B 无抗原微阵列方法与ELISA方法检出结果比较疾病诊断uPA 尿激酶型纤溶酶原激活因子PAI-1血浆纤溶酶原激活因子抑制因子VEGT 血管内皮生长因子第11页，共21页。高通量筛选蛋白-蛋白作用抑制剂药物开发Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 44274431.A 1500 个点阵的微阵列B 局部点阵放大图及SPR信号His6-RB/GST-E7相互作用抑制剂筛选微阵列图加入His6-RB加入含 PepC抑制剂的His6-RB第12页，共21页。 人动脉平滑肌细胞蛋白谱Sukhan

8、ov S and Delafontaine P，Proteomics, 2005, 5, 12741280.蛋白质组学揭示了oxidized low density lipoprotein诱导人动脉平滑肌细胞的作用模式细胞经oxidized low density lipoprotein作用后的蛋白谱检出298个蛋白54个蛋白表达量发生变化4.7% 抗原（一组细胞-细胞间相互作用分子）表达上调；13.4%抗原（结构蛋白，体液响应蛋白）表达下降第13页，共21页。存在的问题成本过高, 需一系列昂贵的尖端仪器芯片的标准化问题 提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除

9、芯片背景对于结果分析的影响等等第14页，共21页。展望蛋白质芯片未来的发展重点 建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法，高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性。 改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异性结合。提高芯片制作的点阵速度；提供合适的温度和湿度以保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像与数据分析一体化。 第15页，共21页。参考文献1 Markus F, et al., DDT, 2002, 7,815-822.2 Bertone P,et al., FEBS Journal, 2005, 272 , 54005411.3 P

10、oetz O et. al, Mechanisms of geing and Development, 2005, 126 ,161170.4 李瑶，基因芯片与功能基因组，2004，32-335 Zhu H et.al, Current Opinion in chemical Biology, 2003,755-63.6 Weissenstein U, Proteomics 2006, 6, 14271436.7 Fang Y，et al., ChemBioChem 2002, 3, 987- 991.8 Sukhanov S and Delafontaine P，Proteomics, 20

11、05, 5, 12741280.9 Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 44274431.10 Schena M, Protein microarrays,2005, 7.第16页，共21页。谢谢！第17页，共21页。蛋白质芯片检测信号的提高Sauera U，et al., Sensors and Actuators B, 2005, 107, 178183.优化芯片制作过程各种参数；使用金粒子作为辅助标记分子；添加SiO2和TiO2层提高表面反射Au-labelled anti-rabbit IgG放大照片Au 的尺寸及其与Dy633的比例 对信号的影响

12、 5 nm Au-particle10 nm Au-particle.第18页，共21页。Protein Microarray SystemThe Protein Microarray System is a complete microarray platform that includes microarray manufacturing, processing, surface chemistry, detection and analysis. TeleChem / It is suitable for a variety of proteomic applications including Micro Multianalyte Immunoassays, protein-antibody, antibody-protein, antibody-antigen, protein