植物细胞工程教学课件第一章实验室基本技术

1、第一章 实验室基本技术华中农业大学生命科学技术学院细胞工程电子课件实验室设置基本技术培养基及其配制细胞培养环境控制外植体接种培养 主要内容1.1 实 验 室 设 置实验室组成基本设备配置培养容器与用具细胞工程实验室的基本要求实验准备 包括培养基配制， 洗涤与灭菌等无菌操作控制培养Culture roomPreparation roomSterili- zing roomSterile operationCytology roomTransi- tion area实验室布局示意图基 本 实 验 室准备室 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。 培养室 培养室的功

2、能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。 接种室 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。辅 助 实 验 室细胞学实验室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。 生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。 摄影室及暗室 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。 基本设备配置基本设备灭菌设备光照培

3、养室与设备无菌操作设备细胞学鉴定设备培养容器与用具1.2 基本技术洗涤技术灭菌技术洗 涤 剂合成洗涤剂铬酸洗涤液 常用的铬酸洗涤液配方 成 分 强酸溶液 中酸溶液 弱酸溶液 重铬酸钾 (g) 63 120 100 硫 酸(ml) 1000 200 100 蒸 馏 水(ml) 200 200 1000 注意事项 在蒸馏水中缓慢加入浓硫酸，加热的同时分次加入磨碎的重铬酸钾至其完全融解。 重铬酸钾加蒸馏水后加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸。 玻璃器皿洗涤 新的玻璃器皿、已使用过的试管、烧杯、三角瓶 、吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品。 塑料用品洗涤 一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较强，因此冲洗时必须

4、反复多次，最后用蒸馏水冲洗。 金属用品洗涤 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤， 需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。 培养基湿热灭菌，即高压高温蒸汽灭菌。 玻璃器皿湿热灭菌或干热灭菌，即在烘箱中加热至15040min，或1202h。 金属器皿干热灭菌。 接种室接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常用甲 醛加高锰酸钾，一般每100ml甲醛加5g高锰酸钾。 培养基体积与灭菌时间的关系培养基体积 （ml）灭菌温度 （） 灭菌时间（min.） 2050 121 20 50500 121 25 5005000 125 35 1.3 培养基及其配制 植物细胞培养基及其配制动物细胞培养基及其配制 植物细胞培养

5、基及配制 培养基基本成分 培养基配方培养基配制无 机 盐 类大量元素 培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千毫克。大量元素包括C、H、O、N、P, K、Ca、Mg、 S。 微量元素 微量元素的用量一般低于10-510-7克分子浓度。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、 Mo、Mn、Co。 有 机 成 分糖 维生素 肌醇 氨基酸 其它 植 物 激 素生长素 细胞分裂素其它其它附加成分琼脂 活性炭 附加复合成分 常用培养基配方常用培养基配方： MS（Murashing and Skoog, 1962） White（White, 1934） B5 (Gambor et al, 1968)

6、N6 (朱至青，1974) 培 养 基 配 制 大量元素配制成10-20 的母液 微量元素配制成100-200 的母液 激素单独配制成mg/ml的母液 培养用培养基按需要按比例加入动物细胞培养基及配制动物细胞培养的营养需求特点培养基配方及培养基选择培养基配制动物细胞培养液的成分及性质氨基酸类（1）必需氨基酸Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Cys、Ser等（2）非必需氨基酸维生素类盐类葡萄糖缓冲系统大多数平衡液采用磷酸盐缓冲系统。HEPEs现被广泛使用，常用浓度为25mmol/L。矿物类有机补充物如核苷类、TCA中间产物、丙酮酸盐、类脂化合物等。激素类如insulin、生长激素、

7、氢化可的松等。生长因子类如血小板衍生出来的生长因子（PDGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、表皮生长因子（EGF）、内皮生长因子及增殖刺激活性因子（MsA）等。培养基配方及培养基选择平衡液溶液（BSS）天然培养液合成培养液无血清培养基其他常用液RingerPBSTyrodeEarleHanksDulbeccoD-hanksNaCl9.008.008.006.808.008.008.00KCl0.420.200.200.400.400.200.40CaCl20.250.200.200.140.10MgCl2.6H2O0.100.10MgSO4.7H2O0.200.20Na2HPO4.H2O1.

8、560.060.06NaH2PO4.2H2O0.050.141.42KH2PO40.200.060.200.06NaHCO31.002.200.350.35葡萄糖1.001.001.00酚红0.020.020.02表1几种常用的BSS（g/L）天然培养液血浆血清胚胎浸出液鼠尾胶原合成培养液人工方法模拟合成如TC199、MEM、RPM-1640、DMEM、Hams F12等。主要成分是氨基酸、vitamin、碳水化合物、无机盐和其他一些辅助物质等。无血清培养基包括基础培养基和附加成分。基础培养基：一般用人工合成的培养液，常用Ham F12和DMEM，1：1混合，加含15mmol/L HEPEs的

9、1.2g/L NaHCO3作基础培养液。附加成分：培养基质（纤维连结素、多聚物、胶原等。）营养成分（转铁蛋白、硒酸钠、胰岛素、生长因子等）酶抑制剂（ 0.1%0.5%大豆胰酶抑制剂）其他常用液消化液1.胰蛋白酶液适用于消化细胞间质较少的组织，常用浓度0.25%、0.125%，T：370C或室温，pH7.4左右。2.Na2EDTA溶液 3.胶原蛋白酶液pH调整液1.NaHCO3液2.10%HAc液3.HEPEs液一种H缓冲剂，可长时间保持较强的缓冲作用，维持恒定的pH值。200mmol/LGln抗菌液青霉素、链霉素（双抗）液 卡那霉素液、制霉菌素液肝素抗凝剂培养基配制BSS配制方法以Hanks液

10、为例：按配方表准确称量试剂；将CaCl2先溶解在100ml 水中；其它成分依次溶解在750ml水中；用数滴5.6%NaHCO3溶解酚红；将2缓慢倒入3中，搅动；将4加入5中；将6移入容量瓶中，补足水混匀；分装盐水瓶中，高压灭菌，40C冰箱保存。1.血浆：选用生长1年左右的健康雄鸡，从鸡翼血管处抽取血液，在有肝素时离心（3000rpm,10min）。取上清分装入若干小瓶，低温冰箱保存。2.血清：从出生1周内的小牛动脉采血，每头小牛放血15002000ml。取血瓶内预先放置30ml生理盐水，以便于血凝块和瓶壁的分离。采血后，血瓶倾斜放置2-4h（室温），待血液充分凝结后移入40C冰箱过夜，让血清析

11、出。次日吸取上清，以4000rpm离心30min，收集血清。血清用蔡氏滤器过滤除菌，分装，细菌培养检查无菌后于低温冰箱保存。天然培养基配制方法3.胚胎浸出液：将911d胚龄的鸡胚磨碎和，加等量缓冲液，离心收集上清，即为鸡胚浸出液，于200C700C保存。1.4 细胞培养环境控制 植物细胞培养环境控制动物细胞培养环境控制1.4.1 植物细胞培养环境控制光照 温度pH气体温度光照包括：光周期、光量和光质三方面。 光量指的是光照强度，因植物类型不同而异。离体培养条件下常用的光量一般为10004000lx。 光质即是光的波长的影响。离体培养下一般用白炽荧光灯进行光照，光谱成分主要是蓝光，光谱波长为41

12、9nm。在离体培养中，根、芽分化的依赖光谱成分不同。光周期指的是光照和黑暗交替的时间，影响细胞脱分化和再分化的效应。 温度控制主要依据植物物种的起源和生态类型来决定。依植物生活习性可将其分为喜温性植物和冷凉性植物两大类型。喜温性植物培养温度一般控制在26-280C，冷凉性植物培养温度一般控制在18-220C或低于250C为宜。 在大多数情况下，适温有利于细胞分裂，即可以提高细胞分裂速率，而适当提高温度则有利于细胞生长，在一定范围内降低培养温度则使细胞分裂和生长速度均减缓，而且使细胞的质量增加。 湿度条件：培养过程对湿度要求并不十分严格，因为培养的小环境中相对湿度常达110%。 周围环境的相对湿

13、度低于60%时，培养基容易干涸，会改变培养基的渗透压；相反，若周围环境湿度过高时，培养室易滋生各种细菌和霉菌。周围环境较适宜的相对湿度为7080%。 植物培养通常使用的pH值范围是5.56.5。 pH在4.0以下或7.0以上培养物就不能正常生长。 由于外植体的吸收，引起培养过程中的pH变化；高压灭菌引起pH 变化。 总体上讲，动物细胞忍受低温的能力比忍受高温的能力强。如哺乳低温细胞在45下只能存活1小时，但在25条件下仍然能慢速生长，并维持长时间不死，甚至在4下数小时后，再置于适宜温度下细胞仍然可以正常生长。 1.4.2 动物细胞培养环境控制2. pH动物细胞培养适宜的pH一般在7.2-7.4

14、，低于6.8或高于7.6都不利于细胞生长，严重时会导致细胞死亡。 培养细胞对pH的要求因培养时间长短有关，一般原代细胞要求较严格，而永久细胞系对pH具有较强的忍耐性。 3. 溶氧及气体环境一般细胞在培养初期要求较低的溶氧水平，而在对数生长期或培养后期，对溶氧水平要求增加，如果供氧不足，将导致细胞缺氧而死亡。 除了氧气供应外，还应注意培养基的氧气和CO2的平衡。 4. 渗透压动物细胞培养渗透压包括两个方面的问题： 一是培养基的渗透压维持； 二细胞体内的渗透压维持。 大多数动物细胞对渗透压的忍耐程度较强，只要培养基的渗透压变化不是很剧烈，一般对培养物不会造成致命伤害。 动物细胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶液。1.5 外植体接种培养植物离体培养类型： 组织培养 器官培养 细胞培养 原生质体培养植物材料的培养与外植体选取 外植体灭菌接种培养及培养条件的控制植物离体培养基本程序外植体的来源 外植体（explant）是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料。 用于外植体分离的母体植物材料一般有三种来源： 一是生长在自然环境下的植物； 二是有目的地培育在温室控制环境条件下生长的植物； 三是无菌环境下已经过离体培养的植物。 外植体取材 a. 根据培养需求选择植物部位 b. 多年生植物注意树龄和季节 c. 在不影响培养目的的前提下尽可能选择自然繁殖器官作外植体外植体灭菌外植体清洗整理杀菌剂