紫外分光光度法测定免疫球蛋白A

1、紫外分光光度法测定免疫球蛋白A摘要:本文建立了用紫外分光光度计测定免疫球蛋白A的方法，分别考察了五个条件下在283nm处对测定IgA的影响。在选定的实验条件下,IgA浓度在0.20400卩gML范围内均与283nm处的吸光度呈线性关系，该法已用于人血清中IgA的测定，结果满意。关键词:免疫球蛋白A(IgA)羊抗人免疫球蛋白A吸收光谱测定血清中免疫球蛋白A的含量对诊断和指导治疗肝脏疾病、结缔组织疾病和肾病有实际的临床意义1。目前检测IgA的方法主要有酶免疫分析法、免疫荧光法、免疫比浊法、共振散射法2等。本文将吸收光谱与高选择性的免疫反应相结合，建立了一种定量检测人血清中免疫球蛋白A的新方法。本法

2、具有操作简便、快速，所用仪器简单等特点，用于样品分析，结果满意。1实验方法在10mL比色管中分别加入0.4mLpH值为6.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液,0.30mL经过适当比例稀释的羊抗人IgA溶液,0.60mL的PEG4000一定量的IgA溶液，用二次纯水定容至3mL,摇匀，静置30分钟。用紫外可见分光光度计扫描得到体系的吸收光谱，测定283nm波长处的吸光强度A;不加IgA作空白，测其吸光强度Ib;计算A=AAb。2结果与讨论根据免疫反应原理，lgA抗原与IgA抗体发生特异性结合形成抗原-抗体复合物微粒。PEG为一种无电荷的线性分子的多糖，能够解除抗原抗体周围的电子云和水化层，促进两者靠

3、近并结合成大复合物，加快反应速度。IgA在一定浓度范围内随其浓度的增加，在283nm处的吸收强度呈线性增强，据此可建立IgA的免疫吸收光谱分析法。2.1吸收光谱IgA和羊抗人IgA血清在283nm处都有1个吸收峰，随着IgA浓度增大该吸收峰强度呈线性大大增强。本实验未采用试剂厂家推荐波长340nm,因为在340nm处吸光度值变化幅度小，为了增加灵敏度，本实验采用283nm为测定波长。2.2pH值、缓冲溶液用量的选择分别测定了pH值为5.88.0范围内体系在Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液中A283nm的波动变化。结果表明，当pH值为6.2时，A283nm达到最大值，增加灵敏度的效果达到最好，所以

4、本文选择了pH值为6.2的Na2HPO4希檬酸缓冲溶液；又考察了缓冲溶液的用量从00.8mL对A283nm的影响。结果表明，当缓冲溶液的用量在0.400.8mL时A变化不大，免疫复合物结合较稳定，故选用0.40mL缓冲液。2.3聚乙二醇的选择聚乙二醇简称PEG因分子量不同,对体系的影响不同。分别考察了PEG-4000、PEG-6000PEG-10000用量01mL对体系A283nm的影响。随着PEG用量的增加，AA显著增加，但Ab也有明显增加，当PEG用量为0.8mL时空白值已上升的相当大严重影响了灵敏度。要提高灵敏度就必须得降低空白值，所以本实验选取用0.6mL的PEG4000浓度为60mg

5、mL-1。2.4羊抗人IgA用量的选择分别试验了羊抗人IgA用量为0-0.8mL时对A283nm的影响变化情况。当羊抗人IgA用量为0.30mL时,体系的AA达到最大值。随着羊抗人IgA用量的继续增加，AA呈降低趋势,故本文选取羊抗人IgA血清的最佳用量为0.30mL。2.5温度及反应时间的影响考察了不同温度下对体系的影响。结果表明，室温下AA较大，条件容易简单，容易控制，且灵敏度也较高。同时考察了反应时间的影响，室温条件下30分钟后，反应已完全且实验结果比较稳定，在30分钟内基本无变化。故本文选择在室温条件下进行，反应时间为30分钟。2.6线性关系在选定的实验条件下，分别测定不同浓度ClgA（卩g的吸光强度A283nm并绘制工作曲线，发现浓度在卩gML范围内与A283nm之间存在良好的线性关系；回归方程为：A283nm=0.1869ClgA+0.0204耳关系数为0.998。2.7样品的测定取正常人血清5份，用移样器准确移取100L用水稀释至5mL;再移取100L按实验方法测定，测定结果与人体正常血清中IgA的含量基本一致3。样品由商丘市第一人民医院提供。参考文献姚春艳，俯伟灵.人免疫球蛋白功能及临床诊断方法J.中国新医药,2004,3(3):55.中国煤炭工业医学杂志，2004,7(1