微生物学课件：5 厌氧菌及其检验技术

1、厌氧菌及其检验技术第一节 厌氧菌概述所谓厌氧菌（anaerobic bacteria）就是在其生长繁殖过程中对氧敏感的细菌。在人工培养厌氧菌时，必须要有一个无氧环境，否则既不能生长，也不能生存。由于厌氧菌具有这种特殊的生长要求，所以在一般的细菌培养中，厌氧菌较难在培养基中生长，也很难从临床标本中分离出来。故在微生物学发展早期的相当长的一段历史时期，人们对厌氧菌的认识几乎处于一种空白状态。这种空白状态一直持续到19世纪后期。 19世纪后期，最早发现引起感染的厌氧菌是梭状芽胞杆菌，如破伤风杆菌能引起破伤风；产气荚膜杆菌能引起气性坏疽；肉毒杆菌引起肉毒中毒等。由于早期发现的能引起人类感染的厌氧菌都是

2、具有芽胞的GP大杆菌，即梭状芽胞杆菌，因此，在过去一个相当长的时期内，人们把厌氧菌研究的主要精力放在了梭状芽胞杆菌及其引起的特殊感染上。 近二十多年来，由于厌氧菌的分离和培养鉴定技术的发展，厌氧菌的检出率不断提高，并且培养出许多无芽胞厌氧菌的新种，因此人们对厌氧菌的分类、基础研究以及它所引起感染的重要性也有了新的认识，这些新认识是：1、厌氧菌分为无芽胞和有芽胞两大类，其中无芽胞厌氧菌分布更广，种类更多。在厌氧菌临床标本中发现约90%以上是无芽胞厌氧菌。2、厌氧菌是人、畜体内正常菌群的重要组成部分，在某些部位它们比需氧菌多得多。例如在粪便中9999.9%是厌氧菌；口腔、唾液中90%是厌氧菌。3、

3、厌氧菌是人体细菌感染的重要病原菌。厌氧菌所致的感染可遍及临床各个学科，人体的各个部位、组织和器官都有厌氧菌感染。据报道，临床送检标本中，厌氧菌阳性率占细菌培养阳性标本的60%，可见厌氧菌具有分布广泛、种类繁多、感染率高的特点。 但在许多疑似感染的病人中，由于细菌检验人员对厌氧菌知识的贫乏，加之客观条件的限制，用常规细菌培养常为阴性，而这些病例可能大多数是厌氧菌感染，结果使得患者得不到及时有效的治疗。因此，了解厌氧菌的生物学特性、致病性及微生物学检查法，对于增强检验人员的理论素质、提高厌氧菌感染的检出率是非常必要的。一、厌氧菌的分类厌氧菌的分类多采用法国巴斯德研究所的Prevot分类法。该法主要

4、根据细菌的形态、革兰氏染色性进行分类。然而近年来由于气象色谱技术在微生物学领域内的广泛应用，对厌氧菌除了其形态染色特性外，检测其终末代谢产物中的脂肪酸，使厌氧菌的分类、鉴定技术水平达到了一个新的高度。目前厌氧菌的分类主要根据两个重要特性即：1、基因型特性：如DNA的碱基比例（G+C百分含量）；2、表型特性：细菌形态（大小、形状、芽胞、游动性等）、细胞壁成分、能量代谢类型和发酵产物。此外，还可根据细菌的耐氧情况和形态、染色、有无芽胞等进行分类。（一）、根据细菌的耐氧能力分类根据细菌对氧的耐受程度以及在一定氧浓度环境中的生存能力，将厌氧菌分为四类：1、专性厌氧菌 特点：（1）、空气中氧含量超过0.

5、5%，在平板培养基上即不能生长；（2）、在空气中暴露10min即死亡，故用一般的培养技术不能从感染处分离出来。2、中度厌氧菌 特点：（1）、培养环境中的氧含量达28%仍能生长；（2）、细菌暴露在室内空气中6090min或在脓汁中离体72h仍不失去活力。3、微嗜氧菌 特点：（1）、细菌在含有510%CO2的空气中在平板上可以生长；（2）、细菌在不含CO2的有氧环境中很难生长。 4、耐氧菌（氧耐受厌氧菌） 特点：（1）、细菌生长需要的特点同需氧菌；（2）、分离出的细菌暴露在空气中经数小时仍可生存。这类细菌与需氧菌既有相同点，又有区别处。相同点：对氧都有一定的耐受性。区别处：需氧菌在生物氧化过程中需

6、要分子氧参与；而氧耐受厌氧菌则不需要氧。也就是说，氧对该菌既无明显毒害，亦无明显益处。（二）、根据细菌的形态、染色及芽孢分类：根据Finegold 1979年的报告，目前已发现的厌氧菌有31个属，245种。其中包括：临床上有芽胞厌氧菌（梭状芽胞杆菌）以产气荚膜杆菌、破伤风杆菌、和肉毒梭菌以及新近发现的难辨梭菌最为重要，但就其发生的频率而言，远不如无芽胞厌氧菌为高。日本长崎大学医学院从1970年 1979年十年间所进行的厌氧菌常规检查，阳性者8634例，其中无芽胞厌氧菌占96.5%；有芽胞厌氧菌仅占3.5%。二、厌氧菌的生理特性（一）、细菌的生物氧化所谓细菌的生物氧化是指有机物质在细菌体内氧化分

7、解释放能量的过程。氧化通常有加氧、脱氢和失去电子三种方式。细菌进行的生物氧化主要为脱氢和失去电子两种方式，很少有加氧反应。脱氢反应的过程，大体上是由某一底物（营养物）作为供氢体，经脱氢酶的催化作用，将供氢体上的氢脱下，经过许多中间递氢体的传送转运，最后把脱下的氢送至受氢体完成反应并获得能量。在此反应中，供氢体脱去氢而被氧化；受氢体接受氢而被还原。因此，生物氧化过程实际上是一系列氧化还原反应的过程。失去电子的过程亦大致如此，但须通过细胞色素和细胞色素氧化酶传递电子。脱氢反应中也包含了失去电子，受氢体实际上也就是电子受体。细菌在生物氧化过程中，最终受氢体或电子受体的种类不同，其生物氧化的方式也不同

8、。 以有机物为受氢体或电子受体的生物氧化过程，称为发酵。酶系统不完善的细菌主要通过这种方式获能。发酵的生物氧化过程不彻底，所产生的能量很低。通过无氧发酵，1分子葡萄糖只能产生2分子ATP，仅为需氧呼吸所产生能量的1/19。以无机物为受氢体或电子受体的生物氧化过程，称为呼吸。其中以分子氧为受氢体的称需氧呼吸；需氧呼吸伴有氧化磷酸化作用，产生大量能量并以高能磷酸键形式贮存于ATP中。1分子葡萄糖经三羧酸循环完全氧化后，可以产生38个分子ATP以供细菌合成代谢和生长繁殖之用。而以非氧的其它无机化合物（如硝酸盐、硫酸盐）为受氢体的称厌氧呼吸。不同的细菌其生理机能不同，故其生物氧化的方式也不同。需氧菌以

9、分子氧作为终末受氢体，因而只能行需氧呼吸；厌氧菌不能利用氧，只能行无氧酵解（发酵）和厌氧呼吸；兼性厌氧菌可利用上述两种方式获得能量。致病菌获得能量的基质主要是糖类，通过糖的氧化或酵解释放能量，并以高能磷酸键的形式（ADP、ATP）储存能量。（二）、氧化还原电势与厌氧菌生长繁殖的关系为什么电子总是从锌棒流向铜棒呢？这是因为在锌、铜棒及溶液之间存在着电势差。铜棒、锌棒及溶液之间产生的电势差叫电极电势，电极电势是由于金属的氧化还原反应造成的，故也叫氧化还原电势，用Eh表示。在任何氧化还原系统中，都存在氧化还原电势，其电势的高低是由系统中所含氧化型或还原型物质的浓度所决定的。氧化还原电势（Eh）系指一

10、种接受电子（还原）或放出电子（氧化）的电势，其大小与物质的含氧量密切相关。氧化还原电势的计算公式为：氧化还原进行的方向与Eh的高低密切相关，一般认为：Eh较高的氧化型物质，能氧化Eh较低的还原型物质，反之则不能氧化。一般培养基的Eh为+0.20.3V；需氧菌生长繁殖所具有的Eh 为+0.30.4V；厌氧菌则需在0.2V以下才能生长。固体培养基可因在大气中放置而被氧化，培养基表面Eh上升，对厌氧菌生长不利；液体培养基亦可因溶解氧而不利于厌氧菌生长，故在进行厌氧培养时，培养基在使用前应作预还原处理，使Eh降低后方可使用。（三）、厌氧菌在有氧环境中不能生长的原因 1、 厌氧菌缺乏细胞色素和细胞色素氧

11、化酶 在有氧的情况下，培养基中的物质被氧化，转化成氧化型的物质较多，需要Eh较高的酶才能将其氧化。需氧菌及兼性厌氧菌具有Eh较高的酶（如：细胞色素和细胞色素氧化酶）可直接或间接氧化这些具有较高Eh的物质；而厌氧菌缺乏细胞色素和细胞色素氧化酶，因此，不能氧化Eh较高的物质，最后因能量供给不足而死亡。2、 厌氧菌缺乏过氧化物酶和过氧化氢酶 当有氧时，细菌生长由需氧脱氢酶催化有氧氧化，产生过氧化氢。过氧化氢能抑制乙酰辅酶A的分解，因而阻碍细菌的脂类、糖类代谢。脂肪酸的-氧化作用（1）、脂肪酸的活化：活化过程是指脂肪酸转变为脂肪酰CoA的过程。（2）、脂肪酰CoA进入线粒体。（3）、-氧化反应过程；脂

12、肪酰CoA进入线粒体后，在基质中逐步进行氧化降解，此氧化过程发生在脂肪酰基的-碳原子上，故称-氧化。每一-氧化过程包括四个连续的反应，即；脱氢、水化、再脱氢、硫解。最后生成一分子乙酰CoA和比原来少两个碳原子的脂肪酰CoA需氧菌及兼性厌氧菌均具有过氧化氢酶（触酶）或过氧化物酶，可将过氧化氢分解，使细菌免受毒害，其反应如下： 触酶2H2O2 2H2O + O2 过氧化物酶厌氧菌缺乏此类酶，在有氧环境中易被过氧化氢杀灭。3、厌氧菌缺乏超氧化物歧化酶Mc Cord等（1971）提出了歧化酶的新理论来解释氧对厌氧菌的毒害作用。他们认为某些细菌氧化代谢的最终产物是超氧化物游离基O2，O2是具有高度氧化能

13、力的基团，对细菌的毒害作用要比过氧化氢大得多。需氧菌及兼性厌氧菌均具有超氧化物歧化酶，可将O2转化为过氧化氢，再通过过氧化氢酶将其水解为水。其反应式为；而厌氧菌缺乏超氧化物歧化酶，因而不能消除O2的毒害作用。根据研究发现兼性厌氧菌具有细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶；微需氧细菌无前二种酶，但有歧化酶；而厌氧菌三种酶皆无，所以在有氧环境中不能生长。三、厌氧菌的分布厌氧菌的分布非常广泛，自然界中的土壤、沼泽、湖泊、海洋、河流的沉渣、污水、食物以及人和动物的体内都有厌氧菌存在。正常人的腔道包括口腔、肠道、泌尿生殖道等处均有大量的厌氧菌寄居，它们与需氧菌一起共同组成人体的正常菌群。从表中所见

14、，厌氧菌主要分布于口腔、上呼吸道、肠道及女性生殖道的粘膜表面，与需氧菌相比，厌氧菌是这些部位在数量上占绝对优势的寄生菌。如口腔和女性生殖道厌氧菌的数量比需氧菌多10倍；而在肠道则高达1000倍。上述部位存在的厌氧菌种类也不尽相同。如口腔和上呼吸道主要寄生着产黑素类杆菌、口腔类杆菌、核梭杆菌、和各型厌氧球菌及放线菌等；在肠道则主要寄生着脆弱类杆菌、各型厌氧球菌、梭状芽孢杆菌、真杆菌和双歧杆菌等；在女性生殖道主要寄生着产黑素类杆菌、消化球菌、梭状芽孢杆菌、和乳酸杆菌等。在正常情况下，寄居于人体的这些正常的厌氧菌群对人无害，与人体保持着平衡状态，并对人体起着一定的保护作用（如人体皮肤上存在着大量的痤

15、疮丙酸杆菌，它能够产生抗菌性脂类，可抑制金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的生长）。但人体与正常菌群之间的平衡状态也是可变的、有条件的，当机体防御功能减弱时，或寄居的正常菌群变化，厌氧菌离开正常寄居部位转移到组织内，即可导致内源性感染。第二节 厌氧菌感染的原因及指征 一、厌氧菌感染的原因任何感染的发生都是微生物与机体两者之间相互较量的结果，厌氧菌感染亦不例外。但厌氧菌大多来自正常菌群，故机体的免疫状态更为重要。一般说来，厌氧菌感染的原因主要有：（一）、组织氧化还原电势（Eh）的降低 组织氧化还原电势（Eh）降低是厌氧菌繁殖的重要条件。在正常情况下，人体组织的Eh可阻止厌氧菌的繁殖。组织缺氧或Eh降低

16、可造成厌氧菌生长繁殖的适宜环境，使机体易于遭受厌氧菌的感染。造成组织缺氧或Eh降低的原因很多，如局部组织血液供给障碍，见于血管损伤、肿瘤压迫、烧伤、动脉硬化、组织水肿、坏死、异物等。此外，大面积外伤、枪伤、刺伤等均可造成组织氧张力或Eh降低，从而为厌氧菌感染提供良好的条件。（二）、机体免疫功能下降机体免疫功能下降也容易并发厌氧菌感染。如接受免疫抑制剂、抗代谢药物、放射治疗、化学药物治疗的患者，其全身免疫功能受损，厌氧菌感染率相当高；糖尿病患者和慢性肝、肾疾患的晚期、开放性骨折、胃肠道、生殖道手术、老年人、早产儿等均因免疫机能受损或不足，而易并发厌氧菌感染。此外，长期应用氨基糖甙类抗生素，或长期

17、应用头孢菌素、四环素等无效的患者，均可诱发厌氧菌感染。（三）、细菌的协同作用 在厌氧菌感染中，有许多情况是与需氧菌、兼性厌氧菌的混合感染。这种混合感染，细菌间的协同作用是一个值得注意的问题。实验表明，当破伤风杆菌的芽孢单独注入豚鼠组织内时，芽孢不能发芽；但若同时注入兼性厌氧菌时，则可引起组织还原，造成局部Eh下降，使破伤风杆菌的芽孢出芽、生长、产生毒素、引起相应疾病。需氧或兼性厌氧菌的这种协同作用主要表现在两个方面：其一：前者的生长耗竭了环境中的氧，降低了环境中的Eh，更有利于厌氧菌的生长。其二：需氧菌还提供了厌氧菌所缺乏的酶及其它生长必需因子，因而使厌氧菌得以生长繁殖，导致厌氧菌的感染。 如

18、产黑素类杆菌和类白喉杆菌协同引起粘膜坏死，前者致病，其生长繁殖过程中需要维生素K后者不致病，但其代谢过程中能产生Vit-K供给前者，两者协同而引起坏死，故类白喉杆菌是助长产黑素类杆菌病原作用的重要共生菌。此外，大肠杆菌与类杆菌亦有上述协同作用。类杆菌缺乏过氧化物酶，不能解除过氧化氢的毒害作用。与大肠杆菌共生时，大肠杆菌能提供过氧化物酶，可将过氧化氢分解为水而解除其毒性，从而有利于类杆菌生长。故两者共生时易发生厌氧菌感染。 由此可见，对氧的需求完全相反的两种以上的细菌可以共生，通过它们的代谢产物改变感染部位或邻近组织的环境条件，有利于协同型细菌的生存和繁殖。一般认为，单纯需氧菌和单纯厌氧菌引起的

19、败血症较少，所以细菌的协同作用是厌氧菌感染致病的一个重要因素。 （四）、机体屏障作用的破坏 例如手术时造成皮肤粘膜的创伤，厌氧菌趁机侵入周围组织而引起感染。肠切除术后易发生类杆菌感染原因即在于此。 由于上述原因，一旦厌氧菌进入适合其生长繁殖的感染部位，即可进行繁殖并损伤组织，由坏死组织吸收残余氧而进一步降低Eh，更有利于其大量繁殖并产生内、外毒素、侵袭性酶、酸类、气体及其它毒性产物，造成组织进一步损伤、坏死甚至全身中毒。二、厌氧菌感染的临床指征1、病理标本发出恶臭味；2、感染部位多靠近粘膜附近；3、病变局部有坏死组织，或深部外伤感 染；4、病变组织内含有气体或放出气体；5、常规血培养阴性的细菌

20、性心内膜炎；6、与恶性变有关的感染，或这种感染具有组织破坏和血循环损害的过程；7、长期使用氨基糖甙类药物无效的感染；8、 脓毒性血栓性静脉炎；9、 伴有黄疸症状的菌血症；10、病变部位渗出物发黑色，在紫外灯照射下发红色荧光，是产黑素类杆菌感染的特征；11、病变渗出物中有硫磺颗粒，提示放线菌感染；12、具有典型的气性坏疽特征；13、有厌氧菌侵入可能的感染如脓毒性流产、胃肠道手术后的感染等。上述感染的临床指征，提示厌氧菌感染的可能性较大，临床细菌检验人员可根据这些特点，采用适当的取材方法，以便得到适合于厌氧菌培养的标本。三、厌氧菌感染的细菌学指征1、标本直接涂片，革兰氏染色镜检发现细菌不均匀、呈多

21、形性者；2、标本直接涂片发现细菌而常规培养阴性者；3、在厌氧培养中，对灭滴灵纸片敏感者；4、血平板厌氧培养出现双溶血环菌落，或菌落发黑色，或在紫外灯照射下发出荧光；5、菌落向琼脂中凹陷，或有反光和不透明的菌落。第三节 厌氧菌的细菌学检验 一、标本的采集与送检（一）、标本的采集厌氧菌标本的采集原则：根据不同的临床症状采集不同的标本。具体来说，可按下述方法采集：1、肺分泌物、胸腔积液：肺分泌物可利用支气管镜和双导管保护下用支气管刷采取；胸腔积液可直接穿刺抽取。2、脓胸及未溃破的脓肿：可消毒皮肤后，用无菌注射器抽取，并立即排净针管及针头内的气体，将针头插入无菌橡皮塞内送检。3、尿液：用无菌注射器直接

22、从耻骨上缘行膀胱穿刺术，抽取后按上法送检。4、血液：可用两端接有无菌针头的塑料或橡皮导管，将一端针头刺入静脉，待血液流出后，将另一端针头立即插入预先抽成负压的培养瓶内，使血液直接流入培养瓶。5、窦道、深部脓肿：皮肤消毒后，可直接抽取，或用无菌导管或采样器采取。6、女性盆腔脓肿：可直接由穹隆处抽取；子宫分泌物用无菌导管抽取。由于人体许多部位都存在着厌氧菌的正常菌群，因此，采取标本时必须注意避免正常菌群的污染。若有些标本难以避免污染，则这些标本培养出的厌氧菌未必是真正的致病菌，故这些标本都不宜作厌氧培养。具体说来：如痰和气管抽出物、鼻咽拭子、齿龈拭子、回肠、结肠造瘘术的流出物、胃、小肠和大肠内容物

23、等都属于含有大量正常菌群的标本，均不宜作厌氧菌检查。（二）、标本的送检标本采集后应立即送检，并尽可能保持在无氧条件下进行。具体方法有： 1、针筒运送法：该法可用来运送各种液体标本，如血液、脓液、胸腹水等。用无菌注射器抽取标本后立即排净空气，针尖插入无菌橡皮塞以隔绝空气，即可送检。2、无菌小瓶送检法：用无菌小瓶（洗净的青、链霉素小瓶）装入0.5ml含有0.0003%刃天青的脑心浸汤。其中刃天青是氧化还原指示剂，有氧时呈粉红色，无氧时无色。加橡皮塞后用铝盖密封。用真空泵抽出瓶中空气，再充入含10%CO2和85%N2及5%H2的混合气体，此时培养基呈无色状态（贮存后如有氧气渗入，培养基呈粉红色，应弃去）。将标本0.51ml注入瓶内即可送检。也可用浓度相同的美兰代替刃天青作为氧化还原指示剂（美兰在氧化状态下为兰色，还原状态下为无色）。3、标本充盈法