微生物实验课件：实验五 抗菌药物敏感试验（一）-纸片扩散法

1、实验五、抗菌药物敏感试验（一）纸片扩散法一、目的要求1.掌握纸片扩散法（Kirby-Bauer法）原理、操作方法、结果的判读及其临床意义。2.掌握纸片扩散法的质量控制。二、器材及抗菌纸片1.菌种 某株待测的表皮葡萄球菌2.培养基 水解酪蛋白琼脂90mm培养基。3.抗菌药物纸片 红霉素（E 15g/片） 克林霉素（DA 2g/片） 青霉素G（PEN 10g/片） 庆大霉素（GEN 10g/片 ） 环丙沙星（CIP 5g/片） 苯唑西林（OXA 1g/片） 万古霉素（VAN 30g/片 ）4.其他 无菌生理盐水、比浊仪、无菌棉签、小镊子、刻度尺等。水解酪蛋白琼脂（Mueller-Hinton琼脂）

2、配方（1000ml）：琼脂 17g牛肉浸出粉 300g可溶性淀粉 1.5g酪蛋白水解物 17.5g最终pH7.27.4 优点1）绝大多数病原菌（除苛养菌、厌氧菌和抗酸杆菌外）在此培养基上生长。2）不拮抗抗菌药物的活性。3）商品的批间差异小，优于其他培养基。三、操作步骤1.原理 1）将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待测菌的M-H琼脂平板上某一点，该点称为抗菌药源。纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后,借其分子的扩散能力向琼脂中扩散形成了随着与药源距离加大，琼脂中药物浓度逐渐减少的梯度浓度。其药源周围一定区域的琼脂内药物浓度高于抑制该待测菌所需浓度时，则该区域细菌不能生长，形成透明抑菌圈。2）

3、抑菌圈的大小可以反映待试菌对该测定药物的敏感程度，并与该药对待试菌的MIC呈负相关关系。抑菌圈 含药纸片 2.操作方法：1）制备M-H琼脂板：将高压灭菌的MH琼脂冷却至56无菌倾注于直径为90mm的平板中，使琼脂的厚度4mm。2）调制菌悬液：以无菌操作，用无菌棉签挑取培养1824h的BA待测菌12个菌落置于1支3ml无菌生理盐水试管中，混匀菌悬液，在比浊仪上矫正浊度为0.5麦氏单位标准的浊度（或浊度与0.5麦氏标准比浊管一致）。取待测菌置于无菌生理盐水中，校正其浊度相当于0.5McFarland 单位（此浊度相当于1.5108cfu/ml含菌量即1.5亿个细菌）3）均匀密涂接种平板：用无菌棉签

4、浸入菌悬液中，将棉签拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在3个方向涂抹琼脂表面后，在平板上作密涂接种，每次涂完整个平板，将平板旋转60（至少旋转两次 ），直到菌液均匀分布在琼脂表面，最后沿平板内缘涂抹1圈，保证涂布均匀，盖上平板的盖子。用无菌棉签浸入菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向均匀涂抹琼脂表面（每次转60）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。 4）贴纸片：a.均匀密涂完细菌盖上平板的盖子后，室温放置310min，待平板上菌悬液的水分被琼脂完全吸收，但放置不宜时间太久，否则在贴纸片前细菌已开始生长可使抑菌圈缩小。b.根据不同菌株挑选相应的抗菌药物

5、纸片，挑选纸片的原则参照美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute ，CLSI）的原则进行。c.用无菌的小镊子将抗菌药物纸片帖于MH琼脂表面某一点，两纸片中心距离=24mm，纸片中心距平板内缘15mm，90mm平板最好贴6张。d.贴上纸片后用镊子压一下，使其贴平贴紧，一旦纸片贴上后，不能随意移动，因为纸片中的药物此时就开始自动扩散到琼脂中，贴好所有的纸片后置室温15min后再倒扣平板，作上标记。 用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂 的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中 心距离应大于24mm，纸片距平板内

6、缘应大于15mm。CLSI抗菌药物的分组1.A组：常规首选试验和报告的抗菌药物。2.B组：首选试验，选择报告的抗菌药物。a.当细菌对A组同类药物耐药时可选用。b.特定的标本来源：CSF中肠杆菌科细菌用三代头孢。c.多种微生物感染。d.多部位感染。e.对A组药物过敏。3.C组：替代性或补充性抗菌药物，在以下情况进行测试和报告：a.医院潜在对数种基本药物（如-内酰胺类）耐药的菌株，已造成局部的或广泛流行时。b.对基本药物过敏的患者。c.治疗少见菌感染（氯霉素用于肠道外分离的沙门菌）。4.U组：仅用于或首选治疗泌尿道的抗菌药物（如呋喃妥因和某些喹诺酮类）。5）孵育：将平板放入35培养箱，最好将平板单

7、独摆放，若堆放，最好不超过两个平板的叠加，以使其都能受热均匀，1824h孵育后，读取结果。6）判定结果：培养后取出平板，从平板背面用刻度尺分别量取待测菌的抑菌圈直径（通过抗菌药物纸片的中心量取），记录数据，根据CLSI的判断标准，报告待测菌对该抗菌药物是敏感（susceptible，S）、中介（intermediate， ）还是耐药（resistant，R）.a.敏感（S）由待测菌引起的感染，可用该抗菌药物常用推荐剂量通过恰当治疗而达到治疗目的。b.中介（）意味着抗菌药物可通过提高剂量或在机体生理浓集的部位具有临床效力（如尿液中的喹诺酮类）。c.耐药（R）待测菌不能被该抗菌药物的常用剂量在组织

8、内或血液中达到的浓度所抑制，和（或）证明抑菌圈直径落在可存在某些特定的微生物耐药机制的范围内（如产-内酰胺酶）并且治疗研究显示药物对分离株的临床疗效不可靠。表皮葡萄球菌纸片扩散法解释标准（CLSI2012） 纸片含量 抑菌环直径(mm) 抗菌药物 (g/片) S R苯唑西林 1 - - -青霉素 10单位 =29 =23 1422 =21 1520 =15 1314 =21 1620 =15万古霉素 30 - - -7）量取待测菌抑菌圈的注意事项a.抑菌圈的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限，在抑菌圈内极其细小的菌落可忽略不计。b.有的菌株（变形杆菌）可出现蔓延生长，在抑菌圈内生长的薄菌层可忽略

9、不计。c.由于培养基内的抗药成分（如超高浓度嘧啶核苷和胸腺嘧啶）与磺胺类药物有拮抗作用，能使磺胺类药物抑菌圈内出现轻微的细菌生长，生长层小于20%可忽略不计。d.如某抗菌药物对待测菌没有抑菌圈，记录纸片直径6mm，报告R。e.质控菌的每一种抗菌药物抑菌圈直径也必须在CLSI允许的范围内（在控），若失控测试菌相应的抗菌药物纸片抑菌圈直径没有意义，必须查找原因重新测试。K-B法操作步骤挑混比涂贴量四、注意事项1.在临床微生物检验中涉及不同的菌株时，对抗菌纸片的选择也应不同，具体可参考美国的CLSI标准。2.为了保证药敏试验结果可靠，一般按照一定的规律采用标准菌株同时进行药敏试验作为质量控制方式，以

10、判断抗菌纸片的质量、M-H平板的厚度、孵育时间、操作过程和观察时间等是否合格。3.标准菌株在控的情况下，试验菌株的结果才能做出判读；若标准菌株失控，试验菌株的结果没有意义，需要找出失控的原因，重新检测。五、质量控制1.质控的方法平行试验：用金黄色葡萄球菌菌标准菌株ATCC 25923与常规实验相同的操作方法，测定质控菌的抑菌圈。作为常规药敏试验室内质量控制。2.抑菌环质控范围：抗菌药物对质控菌株的抑菌圈允许范围参考CLSI规定范围。1）这个范围为95%的可信度，即实验室日间质控得到的抑菌圈直径，在连续20个数值中，仅允许有1个超出这个范围。2）如果经常有质控结果超出这个范围，说明实验方法不稳定

11、。3）每日质控抑菌圈直径的均值应接近允许范围的中间值，否则，操作中有不规范之处，因予以调整。4）一旦发现失控，应从培养基、纸片、接种菌液和操作等各方面去查找原因，并及时纠正。金黄色葡萄球菌ATCC25923纸片法质量控制允许范围(mm) 纸片含量 抑菌环直径允许范围抗菌药物 (g/片) (mm) 苯唑西林 1 1824 青霉素 10U 2637 红霉素 15 22 30 克林霉素 2 2837 环丙沙星 5 2230庆大霉素 10 1927万古霉素 30 1721 六、K-B法药敏试验应遵守准则1.备用纸片应储藏在-20冰箱保存。2.工作用纸片储放在4冰箱中，不超过1个月，同时注意防潮。3.M-H琼脂必须符合试验要求。4.仔细测量抑菌环大小。5.每次试验时，质控菌种的抑菌环，应完全符合CLSI规定范围，最好接近允许范围的中间值。七、常规药敏试验的实用性1.为临床医生合理性用药提供参考。2.进行耐药菌监测及流行病学调查，有效控制耐药菌的发生发展，有效控制院内感染。3.评价新抗菌药物的抗菌谱和抗菌活性等药效学特性，为新药的研究和评估提供有价值的信息。4.对细菌耐药谱进行分析和分型，用来做某种菌种的鉴定。具体要求1.掌握纸片法药敏实验操作的整个过程的每一个环节。2.仔细量