生化研究技术

1、生物化学研究技术许 雷2012.9.1中国农业科学院研究生院蛋白质研究技术中国农业科学院研究生院一蛋白质分离提取、纯化蛋白质鉴定与检测蛋白质结构分析蛋白质表达与复性蛋白质组学核酸研究技术中国农业科学院研究生院一核酸分离提取、纯化核酸鉴定与检测ACBD中国农业科学院研究生院蛋白质、核酸分离提取纯化步骤前期准备材料预处理材料破碎分离提取E纯化ACBD中国农业科学院研究生院1.前期准备提取纯化哪一类蛋白质/目的提取纯化蛋白质/核酸的目的提取纯化蛋白质/核酸的出发材料如何提取纯化蛋白质：文献、通用步骤核酸：常规方法何种组织何种细胞器 水溶或脂溶目标材料选择何种生物来源-动物、植物、微生物胞内或胞外中国

2、农业科学院研究生院ADCB中国农业科学院研究生院2.材料预处理材料采集材料保存材料预冷材料清洗组织细胞破碎不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法研究目的破碎方法不同中国农业科学院研究生院3.1：蛋白质材料破碎植 物A动物微生物适用方法种子、干组织、枝干：组织捣碎鲜活组织：研钵研磨、玻璃匀浆悬浮细胞：组织捣碎、研钵研磨、匀浆、球磨、超声波、酶解毛发、干组织： 组织捣碎、鲜活组织：研钵研磨、玻璃匀浆悬浮细胞：组织捣碎、研钵研磨、匀浆、球磨、超

3、声波、酶解菌丝体： 组织捣碎、研钵研磨玻璃匀浆细胞： 组织捣碎、研钵研磨、匀浆、球磨、超声波、酶解、物化法中国农业科学院研究生院A：组织捣碎机一种较剧烈的破碎细胞的方法可先用家用食品加工机将组织打碎再用10000r/min20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎适用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶芽 （1）机械法B：研磨I：研钵 氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细磨细时局部往往生热导致变性或pH显著变化用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损失适用于细菌或其他坚硬植物材料 II：球磨机适用于干湿性样品的破碎 植物、动物组织矿石、土壤细胞破碎、头发，骨头，基因提取样品等

4、热敏感样品的冷冻研磨制备罐内的球体由于其惯性作用对位于光滑的碾磨罐内额壁上的样品进行带有高能量的撞击，并以此粉碎样品碾磨罐的转动加上碾磨球的运动对样品产生了高强度的混合作用。通过使用多个小球甚至可以进一步的提高混合的效果当使用很多个小球时（如玻璃球），生物细胞就可以被破碎了。球与球之间的摩擦撞击作用可以有效导致细胞的破碎 中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院C：匀浆I：玻璃匀浆细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高适用于少量的动植物脏器组织 （缺陷：不适用团状或丝状真菌，革兰氏阳性菌II：高压均质机用于大肠杆菌、酵母细胞（毕赤酵母、啤酒酵母、汉逊酵母）、动、植物细胞的破壁 材料破碎是在均质阀

5、里进行的，材料在高压下进入调节间隙的阀件时，获得极高的流速（200300m/s），从而在均质阀里形成一个巨大的压力下跌，在空穴效应，瑞流和剪切的多种作用下把原先比较粗糙的乳浊液或悬浮液加工成极细微分散、均匀、稳定的液液乳化物或液固分散物 压力60MPA时材料破碎后粒径为2m以下压力80MPA以上主要用于颗粒超细破碎，能达到1m以下100MPA以上时，能制出更细微的颗粒，破碎粒径为0.1-0.5m以下A:反复冻融 零下15 零下20 冰冻;室温或40 解冻细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，大部分细胞及细胞内颗粒破坏冰片将细胞膜破碎适用动物

6、组织脂蛋白冻结变性急热骤冷 90度冰浴 细菌及病毒超声波频率1020KC、功率200500W， 50100mg/ml细菌中国农业科学院研究生院（2）物理法B：超声波破碎机理：与空化现象引起的冲击波和剪切力有关 空化作用是指存在于液体中的微气核空化泡在声波的作用下振动，当声压达到一定值时发生的生长和崩溃的动力学过程 空化作用一般包括3个阶段：空化泡的形成、长大和剧烈的崩溃当盛满液体的容器通入超声波后，由于液体振动而产生数以万计的微小气泡，即空化泡空化泡在超声波纵向传播形成的负压区生长，而在正压区迅速闭合，从而在交替正负压强下受到压缩和拉伸在气泡被压缩直至崩溃的一瞬间，会产生巨大的瞬时压力，一般可

7、高达5*106帕。 中国农业科学院研究生院超声波适用目标： 多用于细菌材料，用大肠杆菌原核表达制备各种酶及其它G-和G+细菌常选用50-100毫克菌体/毫升浓度变幅杆选用：5ml以下选3mm；5-50ml选用6-8mm；50ml以上选用10mm 频率20KC（随机固定）；振幅变幅杆大小相关；功率200600W（与待破碎材料相关， G-一般200-400W左右， G+一般400-600W以上）超声时间：一般总时间10-30分钟，采用超1s停1-2s-超5s停5-10s，变幅杆越大超-停周期越小中国农业科学院研究生院超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等因素有关 优点在实验室规

8、模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少 存在问题：空化泡破裂时可产生瞬时高温（达5000 ）高温高压导致水电离产生产生的化学自由基团（H+、OH-和氧自由基团）能使某些敏感性活性物质变性失活操作注意散热均有困难，应采取相应降温措施空化作用产生活性氧，所以要加一些巯基保护剂探头一定要接近底部，约1cm 中国农业科学院研究生院A：自溶待破碎的鲜材料在一定pH和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来比较稳定，变性较难，蛋白质不被分解而可溶化自融时时间长，需加少量甲苯、氯仿等应防止细菌污染自融中PH显著变化，随时要调节pH。自溶温度选在04制备活性蛋白质时较少用动物；

9、4 ；微生物 室温利用该法可从胰脏制取羧肽酶 中国农业科学院研究生院（3）化学和生物法B:酶解法溶菌酶、（半）纤维素酶、蜗牛酶、壳聚糖酶、脂酶 （巯基乙醇、尿素增加溶菌酶的敏感性）C:表面活性剂D:细胞膜较脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞胀破E:有机溶媒法 粉碎后的新鲜材料在0以下加入510倍量的丙酮迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末用少量乙醚洗，经滤纸干燥如脱氢酶等可保存数月不失去活性中国农业科学院研究生院分离细胞器某些蛋白提取需要分离细胞器防止其他细胞组分的干扰，细胞破碎后常将细胞内各组分先行分离细胞器的分离一般采

10、用差速离心法细胞器的分离制备、介质的选择最早使用的介质是生理盐水，易使亚细胞颗粒发生聚集作用结成块状，沉淀分离效果不理想现用蔗糖、Ficoll或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。 中国农业科学院研究生院 蛋白质、酶细胞内分布情况细胞器名称 主要蛋白质及酶类细胞核 精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系粒线体 电子传递、氯化磷酸化、三羧酸循环、脂肪酸氧化、 氨基酸氧化、脲合成等酶系内质网（微粒体） 蛋白质合成酶系、羟化酶系溶酶体 水解酶系（包括核酸酶、磷酸脂酶、组织蛋白酶及糖 苷及糖苷酶等）高尔基氏体 糖苷转移酶、粘多糖及类固醇合成酶系细胞膜 载体与受体蛋白、特异抗蛋、ATP酶、环化腺苷酶、 5-核苷酸酶、琥

11、珀酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸酶等细胞液 嘧啶和嘌呤代谢、氨基酸合成酶系、可溶性蛋白类中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院3.2 ：核酸材料破碎动植物、微生物菌丝体A动物微生物 研磨动植物悬浮细胞微生物菌体 直接抽提 相似相溶 提取液C北京市清华大学附属中学 A；直接抽提 B：分离细胞器抽提影响提取的因素 特殊 提取4.分离提取极性（极性分子、离子或带较多极性基团的非极性分子）溶于极性溶剂；非极性溶于非极性溶剂；极性溶液中溶剂介电常数减少-溶质溶解度降低；酸性物质溶于碱性溶剂；碱性物质溶于酸性溶剂中国农业科学院研究生院 盐离子A动物 温度影响溶解的因素 pH化学成分其他物理 因素中国农业

12、科学院研究生院物理因素溶解公式 G：扩散的物质量 D：扩散系数F :扩散面积 c :两界面溶质的浓度差 x:溶质扩散的距离物质分子量越大，扩散系数越小温度升高，扩散系数增大溶液粘度增加，扩散系数减少t :扩散时间 A：提高材料的破碎程度B：充分搅拌C：延长提取时间D：提高提取温度E：降低溶液粘度中国农业科学院研究生院盐离子中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院化学成分去污剂 去污剂是一类既具有亲水基又具有疏水基的物质 分阴离子、阳离子和中性去污剂 两性离子 去污剂具有乳化、分散和增溶作用 中性去污剂对蛋白质的变性作用少，宜于蛋白质提取中国农业科学院研究生院pH：影响

13、蛋白质溶解度 影响核酸溶解度柠檬酸、磷酸钠缓冲液鏊合金属离子抑制蛋白酶 浓度: 醋酸: 0.1-0.15M; 磷酸盐、柠檬酸、焦磷酸盐: 0.02-0.05M; NaCL 多为0.15M 中国农业科学院研究生院4. 提取液缓冲系统构成 磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、Tris缓冲液、醋酸缓冲液、碳酸缓冲液、巴比妥酸缓冲液中国农业科学院研究生院还原剂等蛋白含活性所必需的巯基提取这种蛋白不要带入金属离子和氧化剂提取液中加金属螯合剂如EDTA提取液中加入还原剂如抗坏血酸/DTT防止巯基形成二硫键有某些蛋白质带一些非共价键结合的配基。提取时要注意保护，不要使配基丢失中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生

14、院中国农业科学院研究生院3）：抑制剂EDTA；柠檬酸；草酸；有机溶剂；偏低或偏高pH;蛋白酶抑制剂胰岛素糜蛋白酶降解严重，提取用68酒精溶液并用草酸调pH至2.53.0蛋白水解酶抑制剂-二异丙基氟磷酸、碘乙酸等中国农业科学院研究生院4）其他中国农业科学院研究生院5）多酚、醌类物质对蛋白质提取影响及解决办法多酚最具特征性的反应之一与蛋白结合产生沉淀蛋白质-多酚的结合作用是通过在蛋白质表面形成多配位键(包括疏水作用和氢键),使分离的蛋白质产生交联蛋白质-多酚的结合是可逆的,受多种因素:蛋白质结构、蛋白质和单宁的浓度、溶剂成分、离子强度、pH值和其他物质,如多糖等的影响高pH值环境或有机溶剂都会减少

15、多酚与蛋白质的结合醌类物质与蛋白质的氨基和巯基反应,导致蛋白质失活,并加剧蛋白质沉淀PVPP具有类似蛋白质的内酰胺结构,具有较强的生物相容性和极性,可以通过其内酰胺结构中的N原子和O原子与多酚形成氢键,从而吸附多酚或醌并使其从溶液中沉淀下来中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院6）：110乙醇；15的（甘油、PEG、聚蔗糖、蔗糖、葡萄糖）7）：提取缓冲液pHa: pH 中性；b: pH 36; 9-11破坏所分离的蛋白质与其他杂质的静电结合；c：碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液来进行提取。（前者如cytC、后者如3磷酸甘油酸脱氢酶）d：0，不同溶质的分配系数随

16、相对分子质量的增大而减小。同一溶质的分配系数随双水相系统的不同而改变，这是因为式中的随双水相系统而异。中国农业科学院研究生院2疏水作用在pH为等电点的双水相中，蛋白质主要根据表面疏水性的差异产生各自的分配平衡。疏水性一定的蛋白质的分配系数受双水相系统疏水性的影响。中国农业科学院研究生院2疏水作用双水相系统的疏水性尺度确定PEG/Dx和PEG/无机盐等双水相系统的上相(PEG相)疏水性较大相间的疏水性差用疏水性因子HF (hydrophoblc factor)表示。HF可通过测定疏水性已知的氨基酸在其等电点处的分配系数maa测算中国农业科学院研究生院lnmaa=HF(RH+B)其中，RH为氨基酸

17、的相对疏水性(relativehydrophobicity)，是通过测定氨基酸在水和乙醇中溶解度的差别确定的，并设疏水性最小的甘氨酸的RH0。pHpI时氨基酸在双水相系统中的分配系数与其RH值呈线性关系，直线的斜率就是该双水相系统的HF值。中国农业科学院研究生院盐和缓冲液的影响 盐的种类和浓度对分配系数的影响主要反映在对相间电位和蛋白质疏水性的影响。在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系数，不同电解质的正负离子的分配系数个同，当双水相系统中含有这些电解质时，由于两相均应各自保持电中性，从而产生不同的相间电位，因此，盐的种类(离子组成)影响蛋白质、核酸等生物大分子的分配系数，盐浓度不仅影响蛋

18、白质的表面疏水性，而且扰乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相体积比。例如，PEG/KPi系统中上、下相(或称轻重相)的PEG和磷酸钾浓度以及Cl离子在上、下相中的分配平衡随添加NaCl浓度的增大而改变。这种相组成即相性质的改变直接影响蛋白质的分配系数。 离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利用这一特点，通过调节双水相系统中的盐浓度，可有效地萃取分离不同的蛋白质。中国农业科学院研究生院温度的影响温度影响双水相系统的相图，因而影响蛋白质的分配系数。但一般来说，当双水相系统离双节线足够远时，温度的影响很小，1-2度的温度改变不影响目标产物的萃取分离。大规模双水相萃取操作一般在室温下进行，不需冷

19、却。这是基于以下原因：(1)成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋白质一般不会发生失活或变性；(2)常温下溶液粘度较低，容易相分离；(3)常温操作节省冷却费用。双水相系统的应用 双水相萃取自发现以来，无论在理论上还是实践上都有很大的发展。在最近几年中更为突出,在若干生物工艺过程中得到了应用，其中最重要的领域是蛋白质的分离和纯化，其应用举例如表所示。中国农业科学院研究生院选用一种水溶性非离子多聚物，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝集而沉淀析出 操作时先离心除去粗大悬浮颗粒调整溶液pH值和温度至合适加入中性盐和多聚物至一定浓度，冷处放置一段时间，即形成沉淀乙二醇浓度在350 g/L

20、450 g/L-甘露聚糖酶收率为60%,酶的比活力为13.68倍。 中国农业科学院研究生院双水相体系配制温度：22，按重量配制50%(m/m)PEG溶液和（NH4)2SO4组成双水相体系总质量为10g；由粗酶液量为3g；50%PEG若干；固体硫酸铵若干；水若干混合混合物转到离心管,离心(2000rmin,5min)分相测定上、下相体积,用注射器吸取一定上下相溶液,测定酶活力和总蛋白含量有关计算公式为:R（相比）=上相体积下相体积K（分配系数）=上相萃取物浓度下相萃取物浓度C（萃取率）=RK(1+RK)Ke（酶蛋白分配系数）；Kp（总蛋白分配系数）Ce（酶蛋白萃取率）；Cp（总蛋白萃取率） 中国

21、农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院最适条件PEG分子量：1000PEG浓度：20硫酸铵浓度：15PEG浓度增加，相界表面张力增加，阻止酶/蛋白向下相转移，但上相中分配也降低，多分布在两相间硫酸铵浓度过大易造成盐析中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院z中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院反胶束萃取反胶束(reversed micelle)是双亲物质在非极性有机溶剂中自发聚集体，又称为反胶团 在反胶束内部，双亲分子极性头基相互聚集形成一个“极性核

22、”，可以增溶水、蛋白质等极性物质，增溶了大量水的反胶束体系即为微乳液(microemulsion)。水在反胶束中以两种形式存在：自由水(free water)和结合水(bound water)，后者由于受到双亲分子极性头基的束缚，具有与主体水(普通水)不同的物化性质，如粘度增大，介电常数减小，氢键形成的空间网络结构遭到破坏等。中国农业科学院研究生院反胶束萃取蛋白质的机理蛋白质溶解于小水池中(正萃，或称萃取)，其周围有一层水膜及表面活性剂极性头的保护，使其避免与有机溶剂接触而失活。改变pH、盐浓度等条件蛋白质又可回到水相(反萃)，实现了蛋白质的萃取分离、纯化目的。反胶团萃取蛋白质的机理目前尚不十

23、分清楚。萃取过程是静电力、疏水力、空间力、亲和力或几种力协同作用的结果，其中蛋白质与表面活性剂极性头间的静电相互作用是主要推动力。根据所用表面活性剂类型，通过控制水相pH高于或低于蛋白质的等电点(pI)，达到正萃反萃的目的。中国农业科学院研究生院反胶束萃取蛋白质的应用 同时提取蛋白质和油脂：AO-异辛烷反胶束同时萃取花生蛋白和花生油的过程。萃取后，油进入有机相而蛋白质溶入反胶束中。克服了传统方法工艺复杂，得率低，蛋白质容易变性的缺点。同时用蒸馏方法将油和烃分开，提炼出了油脂 分离蛋白质混合物：Chang在Aliquat336/异辛烷反胶束分离枯草杆菌中两种酶淀粉酶和中性蛋白酶时，通过加入助表面

24、活性剂丁醇，有效地分离了这两种不同等电点的酶 从发酵液中分离和提纯酶：Krishnakant用AOT/异辛烷体系从土豆发酵液中提取酸性磷酸酶，在pH值810，萃取水相与有机相体积比为3：1，反萃水相与有机相体积比为1：1时得到最大活性的酸性磷酸酶Sun在CB-卵磷脂亲和反胶束中加入Tween85，直接从鸡蛋清中提取了溶菌酶。而该反胶束系统还可以回收后反复使用。中国农业科学院研究生院反胶束萃取技术分离胰激肽原酶CTAB溶解于15的正辛烷和正己醇混合液中,配成20mmol /L的无色透明反胶束溶液。粗酶2. 5g溶解于前萃取水相缓冲溶液100ml,磁力搅拌30min,在4, 10000 r /mi

25、n离心30min,取上清液。室温下,取含胰激肽原酶的水溶液2ml和等体积的反胶束溶液置于具塞试管中,漩涡混合2min直至达到萃取平衡,使胰激肽原酶充分转移至反胶束中,静置分相,测定水相中蛋白质含量及酶的活性,计算萃取收率。取萃取分相后的有机相1. 5ml和等体积的缓冲液混合,加入乙醇,漩涡混合,静置至分相。测定水相中的蛋白质含量和酶的活性,计算反萃取收率 正己醇为助表面活性剂，CTAB必须加入助表面活性剂才能形成反胶束其它常用助表面活性剂：正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇和正壬醇，但以正己醇为好中国农业科学院研究生院 漩涡混合时间的影响萃取时间(min) 0. 33 0. 5 1 1. 5 2

26、3E (% ) 78. 57 85. 31 92. 15 95. 62 98. 19 98. 53 CTAB = 0. 02 mol/L,正己醇/正辛烷(V /V) = 1 5,萃取 KBr = 0. 1 mol/L, pH = 9. 0,反萃 KBr = 1. 5 mol/L, pH = 7. 0,反萃15%乙醇(V /V) , 酶 = 1 mg/ml中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院2:过滤1)利用多孔介质

27、截留固体而让液体通过，使固体和液体分离。2)过滤的目的除去不溶性杂质得到所需的清液以便进一步提纯，收集固体中间产物或结晶成品。3)过滤介质要求 (1)孔径大小适于截留被分离的固体成分，孔径过大，则滤液不清，太小则滤速过慢。 (2)孔的数量多，孔道短且不很弯曲，则滤速快，否则滤速漫。 (3)耐酸碱，化学稳定性好。 (4)有一定机械强度，工业上要求易于回收，再生方便，使用寿命长，成本低。中国农业科学院研究生院4) 过滤介质棉、麻、丝织品 适用于沉淀颗粒较粗或较粘稠的中性、弱酸性或弱碱性油科，但不耐强酸强碱。 玻璃纤维，垂熔玻璃、石棉或烧瓷滤板，涤纶 玻璃纤维或垂熔玻璃滤器 耐强酸，但不耐强碱。 石

28、棉或烧瓷滤板 耐强酸、强碱。 涤纶、卡普纶、尼龙66、维尼纶 抗酸碱，耐用，而且不沾料，易再生 涤纶有多种规格，其阻密孔径不同，可根据需要选用。中国农业科学院研究生院过滤介质滤纸 定量分析滤纸 定量滤纸用于定量化学分析中重量法分析试验和相应的分析试验，过滤后需要灰化称量分析实验 定量滤纸灰化后产生灰分的量不超过等于0.0009% 定性分析滤纸 定性滤纸用于定性化学分析和相应的过滤分离，灰化后的灰分重量不超过0.13% 层析定性分析滤纸 层析定性分析滤纸主要是在纸色谱分析法中用作担体，进行待测物的定性分离 中国农业科学院研究生院过滤介质滤纸 滤纸分工业用和分析用两类。 按其材质和滤速的差别又分慢

29、速、中速和快速三种 国外滤纸的型号规格很多，分别适于过滤各种物质 离子交换滤纸 过滤时还兼有分离作用 阴离子交换滤纸：DEAE，ECTEOLA 阳离子交换滤纸：CM 活性炭滤纸 采血用的滤纸无氮滤纸 玻璃纤维滤纸 滤纸不耐强酸、强碱 过滤时滤纸折叠形状对滤速有影响 有平折法与多折法 多折法滤速比平折法高。 中国农业科学院研究生院5)影响滤速的因素： (1) 液体的粘度、温度、压差 (2)滤材的毛细管长度，管径大小或数目多少 (3)滤箔层厚度，越厚，滤速越慢 (4)沉淀中有胶状物或其它可压缩的物质(如细菌或发酵波中的悬浮物等)，均易堵塞滤孔，使滤速大大减慢。 (5)助滤剂-硅藻土，活性炭，纸箱，

30、细砂等，增加滤饼疏松度，防止堵塞过滤介质的孔道。 加助滤剂的方法是在过滤前把助滤剂先均匀铺在过滤介质表面，或与滤液混合一起过滤，滤毕再回收助滤剂。中国农业科学院研究生院6)方式(1)常压过滤- 主要由滤液位差产生推动力引起过滤(2)加压过滤- 用压缩气体加大液体所受的压力或用泵把样液输送至过滤装置时产生液压作为过滤的推动力(3)减压过滤- 在过滤介质下方抽真空，以增加过滤介质上下的压差，推动溶剂通过过滤介质(4)离心过滤法-利用离心机产生的离心力促使滤液通过过滤介质中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院3：膜分离 1）原理：溶液中溶质分子的大小、形状、性质等的差别，对于各种膜表现出不同的

31、可透性而达到分离的目的。 膜的作用是有选择地让小分子通过，而把较大的分子羁留。 2）膜分离动力浓度梯度的扩散作用； 膜两边外加的流体静压差 电场作用3）膜分离种类透析、超滤、反渗透、 微滤、电渗析等中国农业科学院研究生院(1)透析(dialysis): 基于分子大小、分子构象与电荷差异，以浓度梯度为驱动力，以透析膜为载体进行的蛋白质浓缩、脱盐和纯化。 与低分子物质比较，蛋白质分子扩散速度慢，粘度大，不易透过半透膜 在分离提纯蛋白质过程中，将混有小分子杂质的蛋白质溶液放于半透膜制成的囊内，置于流动水或适宜的缓冲液中，小分子杂质皆易从囊中透出，保留了比较纯化的囊内蛋白质。 可以选用膜孔径进行蛋白质

32、分级 速度慢、处理量小 Pierce公司等推出透析管中国农业科学院研究生院透析:透析膜介绍表：一些重要的透析膜中国农业科学院研究生院表：Union Carbide各种型号透析管的渗透范围中国农业科学院研究生院 透析管孔径大小可经机械作用和理化处理而改变。 乙酰化作用可缩小膜的孔径，直至能阻滞甲醇分子通过； 64ZnCL溶液浸泡时，膜的孔径可增大到能使分子量为135,000的大分子通过。 机械法对管膜孔径的影响可因作用方向而异。 线形膨胀可使孔径减小至50； 放射形膨胀作用由于管内液体静压力加大，可使管膜孔径增加12倍以上 某些小分子溶质的渗透性也因溶液中存在某些微量表面活性剂而增加 可能是由于

33、它们吸附在膜的“活性位置上，改变了膜的理化特性。中国农业科学院研究生院表： 不同处理方法对Union Carbide透析管孔径大小的影响中国农业科学院研究生院 商品透析管膜常涂甘油以防破裂，并含有极其微量硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质。对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。 用50%乙醇慢慢克沸一小时，再分别用50%乙醇，0.01M碳酸氢钥溶液，0.001MEDTA溶液依次洗涤，用蒸馏水浸洗三次。 50%乙醇处理对除去具有紫外吸收杂质有效。 处理好的膜可贮存于4蒸馏水中。 长期贮存，加少量叠氮化钠、氯仿，用时蒸馏水漂洗，再以透析时用的溶剂漂洗。 中国农业科学院研究生院 透析袋扎

34、紧底端，透析液不能装满，留一半左右的空间，以防膜外溶剂大量透入袋内时，胀裂或因透析袋膨胀，而引起膜的孔径大小改变。 装透析液后，扎紧袋口。中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院（2）超滤 加压膜分离技术之一，根据被分离物质分子量的大小、形状和性质不同，在一定的压力差使小分子能够通过具有一定孔径的特制薄膜，限额以上的大分子被膜阻留，使不同大小的分子得以分离。 操作简便，成本低廉，分离效率高，且不引起温度、离子状态及相的变化。 膜两边产生压差方式 样液一边加正压；超滤液一边产生负压。前者应用较多。 中国农业科学院研究生院膜名称 分子量截留值 孔平均直径 （Diaflo 超滤膜）XM300 3

35、00,000 140XM200 100,000 55XM50 50,000 30PM30 30,000 22UM20 20,000 18PM10 10,000 15UM2 1,000 12UM05 500 10中国农业科学院研究生院应用：1）废液中蛋白质的回收主要在工业上运用 回收蛋白 溶剂再生 达到排放标准中国农业科学院研究生院2）生物大分子浓缩和脱盐 用超滤法浓缩蛋白或酶时，酶活力损失少(5)，浓缩倍数高，节约能源，设备简单，还能同时除去低分子杂质和部分色素中国农业科学院研究生院3）蛋白质分级分离与提纯实验室与工业并用 超滤法用于蛋白质、酶等大分子的分离纯化时，需23级超滤装置串联使用。

36、串联超滤装置第一级装置选用的膜分子量截留值大于第二级，第二级用的膜分子量截留值大于第三级，其余依此类推。 用色谱分析法测定各级超滤装置的流出液及保留液中的成份，即可知各级的分离效果及组份的纯度。中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院 (4)超滤分离与酶反应器(或发酵)联用固定化酶；连续发酵 超滤分离与酶反应器联用多见于酶促分解反应。 大分子底物酶解成小分子产物后，被超滤除去，羁留下的酶分子和底物返回反应器再行反应。 提高底物利用率、减少酶用量、增加酶反应速度。 已广泛用于纤维素糖化、蛋白酶对蛋白质的水解、淀粉酶对淀粉的水解、大豆酶解产物的分离等。 超滤与发酵联用 超

37、滤回收的营养物继续供给细菌利用 产物及有毒物不断滤去，减少对微生物的抑制。 利用超滤与发酵联用装置连续培养溶组织棱菌，使蛋白酶分泌至胞外，然后用膜分离，除去有毒代谢物，结果酶和菌体的产量都高于常规方法。中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院超滤的浓度极化现象 超滤在密封的容器中进行，外源压力下溶质通过薄膜。开始时溶质分子在溶液中均匀分布，随后小分子溶质通过膜，而大分子溶质被截留于膜面，渐形成浓度梯度，称为浓度极化现象。 大分子溶质在膜上的堆积层(或称浓缩层)，构成超滤膜上附加的次级膜，随着大分子溶质堆积层加厚，膜的选择分离能力愈来愈低，流速也越来越慢。中国农业科学院

38、研究生院超滤装置类型（1）封闭系统天搅拌式装置 简单，没有搅拌装置，浓度极化较严重。膜的使用面积小，滤速慢，常需较大压力。 只适于小量样液。中国农业科学院研究生院封闭系统带搅拌式超滤装置 超滤室内溶液中放铁芯搅拌棒，室外底部的电磁搅拌器通电后可带动搅拌棒缓慢转动。搅拌作用减少了溶液浓度极化现象，使滤速大大提高 3浅道系统超滤装置 使液体通过螺旋形浅道，向与膜平行的方向流动 浅道底部有膜，液体在膜面高速流动，浓度极化不显著 液体与膜接触的面积大于一般搅拌型装置，滤速高。中国农业科学院研究生院中空纤维系统超漠装置 多根空心纤维丝成束组成。 每纤维丝为一个超滤单位 纤维丝横切面内壁的“表层”细密，向

39、外逐渐疏松，形成各向异性微孔膜管结构。 空心纤维管的内径一股为0.2毫米有效面积约1厘米2，表面积与体积的比率极大，滤速很高。中国农业科学院研究生院影响流速率的因素 （1）溶质的分子性质（分子大小、形状和带电性质） 比重大的纤维伏分子扩散性差，对流率影响较大。在一定压力下浓缩至一定程度时，大溶质分子在膜的表面达到极限浓度而形成半固体状的凝胶层，使流率达到极限水平。随着凝胶层增厚，小分子溶质和溶剂也受阻碍，流率越来越慢，最后降到最低点。 比重较小的球形分子较易扩散，在一定压力下虽也形成浓度梯度，但不易形成凝胶层，随着压力的增加，流率也有相应提高。 中国农业科学院研究生院影响流速率的因素（2）溶质

40、浓度 在一定压力下，稀溶液比浓溶液的流率高。 补充溶液进行稀释可减少浓度极化，增高流率。 透滤或加压透析：用于大分子脱盐，在超滤器和压力源之间加贮存瓶，内装新的洗涤液不断补充到超滤器内，超滤器内大分子溶质浓度不变，而小分于溶质和盐类不断被洗涤液洗出至脱尽。中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院 （3）压力 具有高度扩散性的溶质分子和较稀的溶液，增压能增加流率。对于易生成凝胶的溶质，一旦形成凝胶层，增压对流率就不再起作用。 增压常加速浓度极化。（4）搅拌 破坏溶质在膜表面形成的浓度梯度，加快溶质分子的扩散。减少浓度极化，提高流率。 对于易形成凝胶层的溶质，效果更显著。 搅拌速度变大，剪切力

41、加大，易使大分子失活 （5）温度 升高温度可以降低溶液粘度及减少凝胶的形成。温度升高，溶质溶解度增加。提高流率， 温度过高易使活性大分子变性。 （6）其它 溶液pH、离子强度及溶剂性质等因素对流率均有影响。凡能增加溶质溶解度或减少溶质形成凝胶倾向的因素都能增加超滤的流率。中国农业科学院研究生院（7）：超滤类型（8）：膜的性质 a：膜的表观孔径大小影响流率 b：膜的结构类别影响流率 各向异性不对称超滤膜流率大于各向同性的滤膜各向异性不对称超滤膜由很薄的表层(0.1微米或以下)和较厚的多孔基层(200一250微米)粘合而成。 表层薄，有圆锥形(或喇叭形)的孔道，溶剂通透性好，流量大，不易被溶质阻塞

42、。多孔基层厚度大，增加膜的机械强度。中国农业科学院研究生院常见商品滤膜的性质中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院几种超滤装置的规格及用途中国农业科学院研究生院超滤膜选择要求1）额定截留水乎 表示每种超滤膜所规定截留溶质分子量的范围。在这个范围内绝大多数溶质分子能被膜截留。截留分子量愈大，膜的表观孔径愈大，一般选用额定截留水平稍低于所分离、浓缩的溶质分子量。 额定截留水平常以球状溶质分子所得的测定结果表示，纤维状或不规则的溶质分子还应根据实际情况调整2）流速率3） 操作温度： UM、XM、HX、OM型膜耐受温度不超过50度，而PM、HP膜耐受温度可高达120度。 4）膜的无菌措施：一般可

43、用5%甲醇、70%乙醇、环氧乙烷(浓度不超过20%）。有的超滤器(如H1P8、H1P10、H1P100和lOPl00、H10P8等型号)可高压灭菌，有的超滤器(如H1P5和H10P5等型号)则不能高压灭菌。 中国农业科学院研究生院5)可用的溶剂与禁用的溶剂和药物： 不同型号的膜也不完全相同。DM型膜禁用强碱、氨水、肼、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺和m-Pyrol； XM、HX型膜禁用丙酮、乙脂、糠醛、硝基乙烷、硝基甲烷、环酮、胺类和二甲基甲酰胺等； UM型膜禁用强离子表面活性剂和去污刘。 可用的溶剂不能超过一定浓度，磷酸缓冲液浓度不能大于0.05M。HCl和HNO3溶液浓度不能超过1

44、0%，酚浓度不能超过0.5%，碱的pH值不能大干12； PM和HP型膜禁用芳香烃、氯化烃、酮类、芳香族烃化物、脂肪族酯类、二甲基甲酰胺、二甲基亚矾、mPyrol和浓度10%的磷酸等。 各种膜的化学组成不同，对各种溶质分子的吸附情况也不相同。 使用膜时，应选择尽量少吸附溶质的。 磷酸盐缓冲液常增加膜的吸附作用，改用Tris或琥珀酸缓冲液，则可减少溶质的损失和保证超滤时溶剂的正常流速。6）保存 超滤膜较稳定，能连续用i一2年。暂时不用，可在1甲醛格液或5甘油溶液中保存，避免细菌侵蚀及干燥。中国农业科学院研究生院膜的污染 指膜被待分离的蛋白质吸附 1）蛋白质种类与溶液pH 在蛋白质等电点时污染严重

45、荷电膜与待分离蛋白质电荷相同时污染小 强疏水膜与强亲水膜抗污染性强 2）盐 A：无机盐复合物在膜表面或膜孔直接沉淀；或使膜对蛋白吸附增加，以污染膜 B：无机盐改变离子强度，影响蛋白溶解性、构型与悬浮状态，使形成的沉积层疏密程度改变，影响膜透水率 膜的清洗 物理和化学方法亲和超滤 将亲和和超滤结合 过程：亲和结合待截留蛋白超滤杂蛋白 解亲和超滤亲和培基中国农业科学院研究生院（3）微孔过滤 微孔过滤加压膜技术，所用操作压在每平方对5磅以下，膜的平均孔径为0.2-10um，用于分离较大颗粒,如细胞碎片、包含体及蛋白质沉淀物。（4）反渗透 反渗透加压膜技术，作用操作压达500一2000磅旷，膜的平均孔

46、径10埃以下，用于分离小分子溶质及浓缩和脱盐。 A：超滤 B：反渗透中国农业科学院研究生院 A：超滤 B：反渗透其它膜技术：电渗和离子交换电渗中国农业科学院研究生院膜分离技术总述中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院4：离心技术1：概念 在离心力场作用下，加速悬浮液中固体颗粒沉降（或漂浮）速度的方法2：类型1）离心过滤：在有孔转鼓的离心机中通过过滤介质分离悬浮液的过程过滤式离心机2）离心沉降：利用固液两相比重的差异在离心机中进行悬浮液沉降分离沉降式离心机3）离心分离：利用不同溶质颗粒在液体各部分分布的差异。分离不同比重液体的过程为沉降式离心机中国农业科学院研究生院中国农业科学院研究生院离

47、心力 Centrifugal force (F) F=ma=m2r :旋转角速度 r：旋转体离旋转轴的距离 2n = (rad/sec) 60 n：转子每分钟的转数(rpm)相对离心力 Relative centrifugal force (RCF) RCF 就是实际离心力转化为重力加速度的倍数 RCF=F离心力/F重力 =m2r/mg=2r/g =1.11810-5 n2 r g为重力加速度（980.7cm/sec2) 2n = (rad/sec) 60 (2n/60)2 RCF= x r 980.7 =1.11810-5 n2 r Dole&Cotzias制作了转子速度和半径相 对应的离心

48、力列线图。 dx 2r2 (p-m)V= = . 2 X dt 9 d2 (p-m) = . 2 X 18r： 球形粒子的半径 d：球形粒子的直径：流体介质的粘度数 p：粒子的密度m：介质的密度X:粒子离旋转轴的距离沉降速度 Sedimentation velocity 指在强大离心作用下，单位时间内物质运动的距离p-m=0 即p=m V=0 S=0 粒子平衡p-m0 即pm V0 S0 粒子达到某一位置后就达到平衡p-m0 即pm1 V0 Sm。这种方法是根据分离的粒子其在梯度液中沉降速度的不同,使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带,达到彼此分离的目的。 梯度液：起支

49、持介质和稳定剂的作用。pm则S0, 离心时间要严格控制。应用于物质大小相异而密度相同的情况。2.注意点：严格控制离心时间pm事先配成较平缓的连续密度的梯度溶液不能用角式转头、只能用水平式转头不能用刹车(三).等密度离心法1原理 预先配制介质的密度梯度（包含了被分离样品中所有粒子的密度），样品铺在梯度液顶上或混合,离心开始后, 梯度液受离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度,与此同时原来分布均匀的样品粒子也发生重新分布。最后粒子进入到p=m,此时dx/dt为零粒子不再移动，粒子形成纯组分的区带。特点：（1）与样品粒子的密度有关（2）与样品粒子的大小和其他参数无关 （3）转速、温度不变,则延长

50、离心时间也 不能改变这些粒子的成带位置。2.注意点：离心时间要长可用角式转头或水平式转头粒子密度相近或相等时不宜用密度梯度溶液中要包含所有粒子密度不能用刹车四. 梯度溶液的制备(一).梯度材料的选择原则:1、与被分离的生物材料不发生反应。2、可达到要求的密度范围,且在所要求的密 度范围内,粘度低,渗透压低,离子强度和 pH变化较小。3、不会对离心设备发生腐蚀作用。4、容易纯化,价格便宜或容易回收。5、浓度便于测定,如具有折光率。6、对于分析超速离心工作来说,它的物理性 质,热力学性质应该是已知的。 常用的梯度材料：1.糖类: 蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)、右 旋糖酐、糖原 2.无机盐类:

51、CsCl(氯化铯)、RbCl(氯化铷)、 NaCl、KBr等 3.有机碘化物:三碘苯甲酰匍萄糖胺等 4.硅溶胶: 如Percoll。5.蛋白质:如牛血清白蛋白6.重水 7.非水溶性有机物:如氟代碳等 (二).梯度材料的应用范围 1.蔗糖: 水溶性大 性质稳定 渗透压较高 最高密度可达1.33g/ml, 价格低 容易制备, 常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料 有较大的渗透压,不宜用于细胞的分离。 2.聚蔗糖: 商品名Ficoll, 渗透压低 粘度却特别高,为此常与泛影葡胺混合使用 以降低粘度 用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细 胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞 3.氯化铯: 离子性介质 水溶性大

52、最高密度可达1.91g/ml 重金属盐类,在离心时形成的梯度有较 好的分辨率 被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋 白的分离 价格较贵 4.卤化盐类:KBr和NaCl可用于脂蛋白分离KI和NaI可用于RNA分离,其分辨率高于铯盐 NaCl梯度 可用于分离脂蛋白NaI梯度可分离天然或变性的DNA。 5.Percoll:SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮渗透压低对生物材料的影响小颗粒稳定在冷却和冻融情况下还是稳定的 粘度高在酸性pH和高离子强度下不稳定用于细胞、细胞器和病毒的分离 差速离心超离心 密度梯度离心 差速区带离心 等密度梯度离心差速离心：逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降

53、速度不同的颗粒，在不同离心速度及不同离心时间下分批分离。 差速离心一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒，如细胞器、病毒等 。缺点：(1)分离效果差，不能一次得到纯颗故。(2)管壁效应严重。特别当颗粒很大或浓度很高时，在离心管壁一侧会出现沉淀。(3）离心力过大或离心时间过长，容易导致大部分或全部颗粒沉降及使颗粒被挤压损伤、颗粒变形、聚集而失活。差速区带离心：不同的颗粒间存在沉降速度差，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度的不同区域上形成区带。 差速区带离心仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒，与其密度无关。大小相同密度不同的颗粒(如线粒体、溶酶体和过氧物酶体)不能用此法分离。 在离心

54、力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度沿管底沉降。形成不连续区带。沉降系数越大，往下沉降得越快，所呈现的区带也越低。 在离心过程中，区带的位置和形状(成宽度)随时间而改变。离心必须在沉降最快的颗粒(大颗粒)到达管底前或刚到达管底时结束，使颗粒处于不完全的沉降状态，而出现在某一特定区带内。 时间越长，区带越宽。适当增加离心力可缩短离心时间，并可减少扩散所导致的区带加宽现象，增加区带界面的稳定性。 分辨率高低受颗粒沉降速度和扩散系数、离心力和离心时间、梯度介质的摩擦阻力(或粘度) 、颗粒表面积、形状有关 等密度离心： 不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场中，颗粒或向下沉降，或向上漂浮，移动到与

55、它们密度恰好相等位置上(等密度点)形成区带。 区带的形状、位置不受离心时间所影响，体系处于动态平衡。 等密度离心的有效分离取决于颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与大小和形状无关。 颗粒大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带的宽度。 预形成梯度：事先配制不同浓度的介质，铺制密度梯度，样品滴加介质表面。 离心形成梯度 (又称平衡等密度离心)：密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心形成梯度。 预成梯度介质主要是非离子型的化合物(如蔗糖，Ficou) 平衡等密度离心常用的梯度介质有离子型的盐类、三碘化苯衍生物，ludox等 等密度离心时间：以最小颗粒到达平衡点的时间为基准。梯

56、度介质图示 差速离心、 差速区带离心 等密度梯度离心a-d :离心时间从小到大6:色谱技术 色谱技术是一类非常有效的分离有机混合物的方法。 色谱分离是通过混合物在两相间的分配差异来实现的 构成色谱分离的两相，分别称为固定相和流动相，分离时流动相流过固定相。历史A： 1906年俄国植物学家Michael Tswett将色素和溶液通过白垩粒子吸附剂的柱子，分离开的色素形成不同的色带。 此分离技术首次被发现并命名为色谱法（Chromatography），或层析法。 B：1941年Martin和Synge发明了液液（分配）色谱法Liquid-Lipuid（partition）Chromatograph

57、y，LIC。 用覆盖于吸附剂表面的并与流动相不混溶的固定液来代替以前仅有的固体吸附剂。 试样组分按照其溶解性在两相之间分配。 荣获1952年诺贝尔化学奖。C： 1958年，Stah进行经典性的工作将技术和所用材料加以标准化D： 1952年，Martin和James首先描述气相色谱法E：新型液相色谱仪和新型柱填料的发展以及对色谱理论的更深入了解， 引起对密闭柱液相色谱法的兴趣。 高效液相色谱法（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）成为与气相色谱法一样广泛使用的方法， 分离非挥发性的或热不稳定的试样来说，高效液相色谱法常常是更可取的。2）色谱分类

58、（一）按两相所处的状态分类 液体作为流动相，称为“液相色谱”（liquid chromatograp-hy） 气体作为流动相，称为“气相色谱”（gas chromatogr-aphy） 固定相也有两种状态，以固体吸附剂作为固定相 以附载在固体上的液体作为固定相层析法按两相所处的状态分为液固色谱（liquid-solid chromatography）液液色谱（liquid-liquid chromatography） 气固色谱（gas-solid chromatography） 气液色谱（gas-liquid chromatography） （二）按操作形式不同分柱层析（colum chrom

59、atography） 将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析（paper chrmatography） 用滤纸作液体的载体（担体support），点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析（thinlayper chromatography） 将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。（三）按层析过程的机理分类吸附层析（adsorption chromatography ）利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。分配层析（partition chromatography） 利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数（或溶

60、解度）不同，而使之分离的方法。离子交换层析（ion-exchange chromatography） 利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同，而进行分离的方法。凝胶层析（gelchromatography） 利用某些凝胶对于不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异，进行分离的技术。 亲和层析 根据生物分子间亲和吸附和解离的原理，建立起来的色谱法称亲色谱法 聚焦层析疏水作用层析3）分述A：吸附色谱法 吸附色谱法液固色谱法（Liquid-Solid Chromatography，简称LSC） 混合物随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质有不同的吸附力而使混合物分离。 吸附 ： 任何两个相都可以